一种定量检测人血清高敏C反应蛋白的化学发光免疫方法

刘平果，李国强，陈毅歆，罗海峰，黄德党，王颖彬，葛胜祥，张军，夏宁邵

1 厦门大学附属中山医院 肝胆外科，厦门 361004 2 厦门大学生命科学学院 国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心，厦门 361005

一种定量检测人血清高敏C反应蛋白的化学发光免疫方法

刘平果1*，李国强2*，陈毅歆2，罗海峰2，黄德党2，王颖彬2，葛胜祥2，张军2，夏宁邵2

1 厦门大学附属中山医院 肝胆外科，厦门 361004 2 厦门大学生命科学学院 国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心，厦门 361005

旨在建立一种可定量检测人血清高敏CRP的化学发光检测方法(High-sensitivity C-reactive protein quantifiable chemiluminescent immunoassay，hs-CRP CLIA)。首先利用亲和层析和离子交换层析技术从肝硬化病人腹水中纯化出高纯度的天然CRP作为免疫原制备了22株CRP单克隆抗体(单抗)，其中13株单抗在磷酸胆碱配体捕获ELISA中呈阳性，然后利用方正滴定法筛选出单抗10C5和10C11建立了hs-CRP CLIA。试剂盒评估结果显示：该方法对血清中干扰物质IgG、血红蛋白、甘油三酯等无非特异性反应；该方法检测灵敏度高，在0.04～20.38 mg/L范围内定量检测人血清CRP标准品呈良好线性关系(R2＞0.993)；该方法准确性高、可重复性好，平均回收率为99%，批内差为4.2%～5.8%，批间差为9.0%～11.5%；该方法与进口商品化高敏CRP ELISA试剂盒平行比较检测90份血清标本，结果显示两者有良好的可比性(r=0.968)。综上，建立的hs-CRP CLIA是一种准确、可靠、可定量的高灵敏C反应蛋白检测方法，该方法的临床应用，有利于改善我国心脏病风险评估及肠炎性疾病预后判断。

高敏，C反应蛋白，单克隆抗体，化学发光，心血管疾病，肠炎性疾病

Abstract:We developed a high-sensitivity C-reactive protein quantifiable chemiluminescent immunoassay(hs-CRP CLIA).The high-purity native CRP was purified from hepatic cirrhosis patient ascetic fluid by affinity and ion exchange chromatography and used as an immunogen to develop the monoclonal antibodies(mAbs)against CRP.Twenty-two mAbs were identified reactive with CRP in ELISA and 13 of them were reactive in the phosphorycholine ligand capture ELISA.The mAbs 10C5 and 10C11 were selected to develop the hs-CRP CLIA.The linearity and performance of the hs-CRP CLIA was characterized.It was showed notreactive when testing against other serum materials(IgG, hemoglobin and triglyceride).The reliable correlation(R2＞ 0.993)was obtained between testing value(RLU/S)and the concentration of human serum CRP calibrator.The linearity fell in the range of 0.04−20.38 mg/L.The assay has good accuracy and reproducibility, the mean recovery was 99% and the precision of the intra- and inter assay was CVs(4.2%−5.8%)and(9.0%−11.5%), respectively.In testing of 90 human sera, this assay performed well and correlated comparably with a commercial hs-CRP ELISA kit.Thus, hs-CRP CLIA is an accurate, reliable, quantifiable assay for detection of high-sensitive C-reactive protein in serum, it may be useful to improve the risk assessment of cardiovascular disease and the prognosis of inflammatory bowel disease.

Keywords:high-sensitivity, C-reactive protein, monoclonal antibody, chemiluminescent, cardiovascular disease, inflammatory bowel disease

C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)是一种能与肺炎球菌C多糖发生沉淀反应的血浆急性时相蛋白[1]。正常人体血浆中CRP浓度一般低于10 mg/L，在机体出现疾病炎症或组织损伤的 6～8 h后血浆中CRP浓度迅速升高上百倍，在炎症消除后血浆CRP以4～9 h半衰期快速减少至10 mg/L以下，即体内CRP水平升高幅度与炎症感染程度呈正相关，因此CRP在临床上常被用作炎症检测指标[2]。在研究发现炎症是冠状动脉粥样硬化形成的重要因素后[3-4]，CRP作为一种优秀的炎症标志物引起了许多心血管疾病专家的兴趣[5]。目前国内外已有大量临床流行病学研究结果证实CRP是一个理想的心血管疾病发病风险预测指标，人血浆中CRP在0～10 mg/L范围内的浓度高低与未来发生心血管疾病的风险高低有关[6-13]。因此，CRP还是一个评估心脏病发生率、复发率、死亡率的临床重要指标。

临床上使用的CRP诊断试剂大致分成2大类[14]：第一类是普通CRP诊断试剂，其检测灵敏度较低，检测下限不低于 3 mg/L，用作鉴别 CRP浓度介于10～40 mg/L间的慢性炎症和介于40～200 mg/L间的急性炎症。第二类是高敏 CRP诊断试剂(High-sensitivity CRP，hs-CRP)，其检测灵敏度高，检测下限可低于0.3 mg/L，能准确定量0.1～10 mg/L浓度范围内的 CRP，使临床上根据血浆 CRP在0～10 mg/L范围内的浓度高低评估心脏病发病风险的方式得以实现。国外已有基于多种不同方法学的商品化hs-CRP诊断试剂盒，包括乳胶增强比浊法、酶联免疫吸附法、免疫层析法、化学发光法等[15]。其中Dade Behring公司的乳胶增强比浊法产品是第一个被美国FDA批准的专门用于心血管疾病风险评估的国际标准hs-CRP试剂盒，由于该产品需要配备大型生化分析仪、且价格较高，因而限制了自身的推广应用[16]。免疫层析法产品虽然具有操作方便的优点，但其分析灵敏度、定量分析性能等问题仍有待完善。化学发光法与酶联免疫法是新的hs-CRP测定方法，具有更高的灵敏度、准确度、重复性及成本低等优势，其中化学发光法的定量分析能力比ELISA更好，技术也较成熟，容易被临床单位接受，具有较好的应用前景。目前我国临床心脏病风险预测尚较少使用hs-CRP检测指标，除了我国此方面研究起步比国外晚之外，最主要原因是hs-CRP试剂盒主要依赖进口，价格昂贵不利于大规模推广使用，虽然近年来国内诊断公司也有新开发的 hs-CRP试剂盒，但其关键单抗原料也多依赖进口[17-18]。因此，本研究目的是建立天然CRP及其特异性单抗的原料制备方法，然后以识别天然CRP的单抗为原料，基于化学发光检测技术建立一种国产 hs-CRP化学发光定量检测试剂盒(hs-CRP CLIA)。

1 材料与方法

1.1 材料

用作实验对照和特异性分析的材料包括：人血清CRP标准品(Human serum CRP calibrator，Dako Cytomation)、兔抗 CRP多抗(Dako Cytomation)、商品化CRP纯化蛋白(Calbiochem)、人IgG(南京奥多福尼生物科技有限公司)、血红蛋白标准品(上海楷洋生物技术有限公司)、甘油三酯(上海汇普工业化学品有限公司)。富含天然CRP蛋白的肝硬化病人腹水来自厦门大学附属中山医院；人血清标本来自厦门市中心血站。

1.2 CRP蛋白的纯化及鉴定

首先使用高速离心方法(23 000×g，30 min)除去人腹水中的杂质；然后用磷酸胆碱亲和介质(Immobilized p-Amino phenyl Phosphoryl Chloline Gel，PC-Gel，Pierce)按操作说明书提供的方法从腹水中提取出粗纯的CRP蛋白；然后用SDS-PAGE鉴定出含有目标产物的洗脱峰样品，继续在 HPLC上用阴离子交换层析柱(Super Q 5PW 7.5×7.5，TOSOH)纯化，用含有 0.15～1 mmol/L NaCl的Tris-HCl溶液进行梯度洗脱，最终得到高纯度的CRP蛋白透析到含有2 mmol/L CaCl2的Tris-HCl缓冲液中长期保藏于−70℃冰箱。CRP蛋白纯度使用SDS-PAGE鉴定，CRP特异性使用CRP兔多抗进行Western blotting鉴定，CRP分子量大小使用G5000分子筛层析柱(G5000 PW 7.8×30，TOSOH)鉴定。

1.3 CRP单克隆抗体的制备

按常规杂交瘤制备方法[19]，选用6周龄的雌性Balb/C小鼠(北京维通利华公司)，经皮下注射免疫天然CRP蛋白，免疫剂量为100 μg/只，初免用等量福氏完全佐剂，免疫加强用等量不完全福氏佐剂，加强免疫4次，免疫间隔2周，融合前3天静脉注射 100 μg天然 CRP蛋白。收集免疫小鼠的脾脏 B细胞与小鼠骨髓瘤细胞株(Sp2/0-Ag14，Sp2/0)用PEG 1500进行细胞融合，形成的杂交瘤细胞经过ELISA检测、克隆化操作、腹水诱导和纯化获得纯化CRP单抗。单抗采用改良过碘酸钠法[19]标记辣根过氧化酶(HRP)。

1.4 间接ELISA

使用间接ELISA筛选CRP单抗。使用含2 mmol/L CaCl2的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)稀释天然CRP蛋白，按100 ng/孔包被在96孔微孔板上，37℃孵育2 h；然后使用含2%明胶的PB缓冲液在37℃下封闭2 h，甩干封闭液，真空密封保存备用。检测时每孔加入 50 μL单抗杂交瘤细胞上清，37℃孵育30 min，用1×PBST(北京万泰生物药业股份有限公司)洗板5次，加入标记HRP的羊抗鼠二抗100 μL，37℃孵育30 min，PBST洗板5次，加入显色液，10 min后在微孔酶标仪(TECAN)读值。

1.5 配体捕获ELISA

将天然CRP特异性配体偶联蛋白(如PC-BSA)预包被于聚乙烯微孔板上，再通过配体将五聚体CRP结合于微孔板上，避免直接包被导致天然CRP抗原性发生改变，该方法可鉴定 CRP单抗对天然CRP的捕获能力[20]。在96孔微孔板上包被800 ng/孔的 PC-BSA(Bioresearch Technologies)，37℃孵育2 h，然后使用含2%明胶的PB缓冲液在37℃下封闭2 h，甩干封闭液，真空密封保存备用。检测时加入20 ng/孔天然CRP蛋白，37℃孵育30 min，再加入50 μL 分泌CRP单抗的杂交瘤细胞上清，37℃孵育30 min，PBST洗板5次，加入预稀释的羊抗鼠HRP标记二抗100 μL，37℃孵育30 min，PBST洗板 5次，加入显色液，10 min后在微孔酶标仪(TECAN)读值。

1.6 CRP化学发光免疫检测方法的建立

将纯化后的CRP捕获单抗用20 mmol/L的磷酸缓冲液(PB，pH 7.4)溶解，按每孔100 ng包被于聚乙烯微孔板上，37℃孵育2 h，放置4℃过夜，PBST洗液洗板1次，37℃封闭2 h。甩干封闭液，真空密封保存备用。检测时加入100 μL 样品，37℃孵育30 min，PBST洗板5次，加入100 μL CRP酶标单抗，37℃孵育30 min，PBST洗板5次，加入化学发光显示底物(Pierce)，在Orion II微孔板式化学发光检测仪(Berthold)上读取RLU/S值。

1.7 hs-CRP CLIA的实验室评估

利用本研究建立的hs-CRP CLIA检测不同浓度的 IgG、血红蛋白标准品、甘油三酯等血清中常见干扰物质以判定该方法的检测特异性；检测不同浓度范围的人血清CRP标准品，采用回归分析确定该方法的线性检测范围；通过回收率实验和精密度实验判定该方法的准确性和可重复性。

1.8 hs-CRP CLIA与同类试剂盒的比较

美国BIOCHECK公司生产的hs-CRP ELISA试剂盒是一种已通过美国FDA和中国SFDA认证的高敏C反应蛋白商品化试剂盒，选择该对照试剂盒与本研究建立的hs-CRP CLIA平行检测90份人血清标本，使用微孔酶标仪(TECAN公司)读值，检测结果作线性回归分析。

2 结果

2.1 天然CRP蛋白的制备

病人腹水经亲和层析和离子交换层析两步纯化得到天然CRP，再经SDS-PAGE鉴定纯度。如图1A所示，泳道1为经PC-Gel亲和介质一步纯化得到的粗纯CRP，泳道2为再次经Super Q离子交换层析得到的电泳单一纯的纯度约 95%的 CRP蛋白，泳道3为商品化CRP纯化蛋白对照，其分子量约23 kDa，与本研究纯化CRP的分子量大小一致；图1B显示在Western blotting中，所纯化的CRP与商品化CRP兔多抗有特异反应性。进一步在HPLC上用G5000分子筛层析鉴定纯化后CRP的分子量，结果(图2)显示样品主峰出现在约 20 min处，与商品化天然五聚体CRP的出峰位置一致。上述结果表明本研究纯化的 CRP是天然五聚体 CRP，为后续CRP单抗制备提供关键原料。

图1 纯化CRP的SDS-PAGE和Western blotting鉴定图Fig.1 SDS-PAGE and Western blotting analysis of CRP purified from human ascetic fluid.(A)SDS-PAGE analysis.M:protein marker; 1: crude CRP sample eluted by PC-Gel affinity chromatography; 2: high-purity CRP sample eluted by Super Q ion exchange chromatography; 3: commercial native CRP control.(B)Western blotting analysis of high-purity CRP.

图2 纯化CRP的分子筛分析图Fig.2 Molecular exclusion chromatography analysis of the purified CRP protein.

2.2 CRP单抗的制备及鉴定

以纯化天然CRP为免疫原，采用小鼠杂交瘤融合技术和间接ELISA方法筛选出22株能稳定分泌CRP抗体的杂交瘤细胞。配体捕获ELISA分析显示，22株 CRP单抗中有 13株单抗反应阳性，分别是1B10、5D4、7F3、7D9、9D5、10C5、10C11、10F7、12D8、13H9、14H6、15D6、16G2，表明这13株单抗能够结合天然 CRP，其识别表位可能位于五聚体蛋白表面，另外有9株CRP单抗(3D11、4F4、8A3、8D4、12A2、13H4、16C3、16H3、19H3)反应均为阴性，表明这9株单抗不能结合天然CRP，其识别表位可能隐藏于 CRP五聚体内部。进一步用条带Western blotting分析，结果(未给出)显示，22株单抗中只有10C11、8D4和16H3等3株单抗反应呈阳性，提示这3株单抗识别CRP蛋白中偏线性表位，其中捕获ELISA阳性单抗10C11在Western blotting中呈强阳性，而捕获ELISA阴性单抗8D4和16H3在Western blotting中呈弱反应，提示单抗10C11可能识别CRP中优势表位。

2.3 高敏CRP化学发光检测方法(hs-CRP CLIA)的建立

制备上述13株能捕获天然CRP的单抗腹水，经硫酸铵沉淀和DE-52层析纯化得到高纯度CRP单抗，使用过碘酸氧化法标记辣根过氧化酶(HRP)，基于化学发光检测技术，建立检测CRP的双抗体夹心 CLIA方法，采用方正滴定法筛选配对单抗，以灵敏度高、本底低、线性范围广为选择标准，最终确定 10C5为包被单抗，10C11为酶标单抗，建立hs-CRP CLIA。

用hs-CRP CLIA检测人IgG(5 g/L、10 g/L、25 g/L)、血红蛋白(12 g/L、24 g/L、36 g/L)和甘油三酯(2.5 g/L、5.0 g/L、7.5 g/L)等3种血清中常见干扰物质。结果显示hs-CRP CLIA对人IgG、血红蛋白、甘油三酯等3种物质的检测P/N值均小于2.1，表明hs-CRP CLIA有较好的特异性。

将人血清CRP标准品从163 mg/L按2倍倍比连续稀释至0.04 mg/L，然后用hs-CRP CLIA测定稀释后标准品的发光值，经回归分析绘制CRP检测标准曲线，结果(图3)显示，hs-CRP CLIA对浓度介于 0.04～20.38 mg/L之间 CRP有较好的检测线性(R2=0.9938)。

图3 hs-CRP CLIA检测人血清CRP标准品的标准曲线Fig.3 Calibration curve obtained for the hs-CRP CLIA with a linear dynamic range between 0 and 20.38 mg/L of human serum CRP calibrator.

2.4 hs-CRP CLIA的可重复性

本研究使用精密度实验和回收率实验确定hs-CRP CLIA的检测准确性和可重复性。精密度实验中，将人血清CRP标准品稀释成低、中、高3个浓度样品，在同一天内每隔1 h用hs-CRP CLIA测定一次，共测10次，得出hs-CRP CLIA的批内变异系数(CV，%)为4.2%～5.8%，小于标准值10%；取相同样品分成10份冻存，每天测定1次，连续测定 10 d，得出批间变异系数(CV，%)为 9.0%～11.5%，小于标准值15%(表1)，说明hs-CRP CLIA精密度良好。回收率实验中，取人血清CRP标准品稀释成介于0～10 mg/L范围内的不同浓度样品，每份样品重复检测3次，取平均值后，计算回收率(回收率=检测值/实际值×100%)。结果表 2显示，hs-CRP CLIA检测不同浓度CRP标准品的回收率介于 95%～102%之间，平均回收率为 99%，表明hs-CRP CLIA具有较好的检测准确性。

表1 hs-CRP CLIA的精密度分析Table 1 Precision of the hs-CRP CLIA

表2 hs-CRP CLIA的回收率分析Table 2 Recovery of the hs-CRP CLIA

2.5 hs-CRP CLIA与同类试剂盒的比较

用美国BIOCHECK公司生产的hs-CRP ELISA试剂盒与hs-CRP CLIA平行检测90份血清样品，检测结果经线性回归分析(r=0.968，P＞0.05)，显示两者检测结果无显著性差异，具有很好的可比性(图4)。

图4 比较hs-CRP CLIA与BIOCHECK hs-CRP ELISA的检测相关性Fig.4 Comparison between the hs-CRP CLIA and the BIOCHECK hs-CRP ELISA.

3 讨论

本研究的主要目的之一是制备识别天然CRP的单抗原料，为此需要首先获得抗原性正确的CRP蛋白作为免疫原。血清中天然CRP是由5个完全相同的分子量约23 kDa的单体CRP蛋白以非共价键结合而成的平面对称五聚体CRP，分子量约120 kDa。值得注意的是，Potempa等[21-22]发现当天然CRP暴露于尿素、酸液、加热等环境下或直接包被于聚乙烯板上时，天然五聚体CRP会解聚成单体CRP，表现出不同于天然CRP的“neo-CRP”的独特抗原性。而且Ying等[20]证实5类识别表位不同的CRP单抗结合天然五聚体 CRP和单体 CRP的能力不同，提示建立检测血浆中天然CRP的hs-CRP诊断试剂盒需使用构象正确的CRP抗原及其单抗，确保所使用的CRP单抗能够识别血清中天然CRP。本研究曾试图利用原核表达系统表达CRP基因，结果得到的是单体 CRP，目前也尚无研究报道利用基因工程重组表达技术成功表达出天然五聚体 CRP，而且后续利用单体CRP制备的单抗也不能捕获血清中的天然五聚体CRP，进一步证实制备天然CRP的必要性。本研究利用天然五聚体CRP在钙离子帮助下能与配体磷酸胆碱(PC)特异结合的特点[23]，使用 PC-Gel亲和层析介质从肝硬化病人腹水中提取出高丰度的天然五聚体 CRP，进而利用离子交换层析方法得到高纯度的天然CRP，建立了一种获得天然CRP的方法，解决了购买进口CRP蛋白价格昂贵的困扰，大大降低后续CRP单抗的制备成本，目前市场上纯度约95%的进口CRP蛋白的价格约为￥3 000/mg。

为了获得能够特异捕获天然CRP的单抗，本研究参照文献[20]建立了基于 PC-BSA的配体捕获ELISA，该方法能够很好地筛选出特异性结合天然CRP的单抗，为后续筛选最佳的双抗体夹心配对单抗奠定了原料基础。值得注意的是，多数CRP单抗在Western blotting实验中不反应，提示天然CRP的优势表位可能以构象表位居多。单抗10C11在配体捕获ELISA和Western blotting中均有很强的反应性，提示天然CRP表面可能存在一个优势线性表位，这对建立诊断试剂具有重要意义，而后续单抗配对筛选中也证实10C11作为标记单抗具有良好的检测效果。总之，本研究制备的天然CRP特异性单抗为建立hs-CRP诊断试剂盒解决了关键的原料来源，有助于降低我国hs-CRP诊断试剂盒的生产成本，促进临床上早日广泛开展hs-CRP指标检测。

本研究建立的高敏C反应蛋白化学发光定量检测方法(hs-CRP CLIA)采用国际CRP标准品CRM 470(WHO IS 85/506)进行校准，数据显示 hs-CRP CLIA检测特异性良好，灵敏度高，可重复性好，而且定量检测线性范围较宽，能够定量检测 0.04～20.38 mg/L范围内人血清CRP标准品，可鉴别浓度大于10 mg/L的慢性炎症。2003年美国疾病预防控制中心和美国心脏学会联合发布了一个评估欧美人群心脏病发病风险高低的血清CRP水平为：CRP在1 mg/L以下为低风险、CRP在1～3 mg/L为中等风险、3～10 mg/L为高风险[7]。但是，由于中西方存在人种、健康状况、饮食和生活习惯等不同，可能导致我国人群的CRP标准高于或低于欧美人群[24]。因此，本研究建立的hs-CRP CLIA由于具有较广的线性检测范围，将有利于开展我国人群大规模的血清学调查研究，以制定出一个适合我国人群心脏病风险预测的 CRP评估标准。另外，本研究建立的hs-CRP CLIA与美国BIOCHECK的hs-CRP ELISA试剂盒相比，两者检测结果具有良好的可比性，值得一提的是hs-CRP CLIA检测时无需稀释待测血清样品，在操作上比BIOCHECK ELISA方法更方便。

总之，本研究建立的hs-CRP CLIA是一种准确、可靠、可定量的高敏CRP检测方法，有利于我国各级医院和临床单位广泛开展hs-CRP指标检测，有利于提高我国心脏病风险预测水平。

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Chemiluminescent immunoassay for high-sensitivity C-reactive protein

Pingguo Liu1*, Guoqiang Li2*, Yixin Chen2, Haifeng Luo2, Dedang Huang2, YingbinWang2,Shengxiang Ge2, Jun Zhang2, and Ningshao Xia2
1 Department of Hepatobiliary Surgery, Zhongshan Hospital, Xiamen University, Xiamen 361004, China 2 National Institute of Diagnostics and Vaccine Development in Infectious Diseases, School of Life Sciences, Xiamen University, Xiamen 361005,China

Received:February 3, 2010;Accepted:April 12, 2010

Supported by:National High Technology Research and Development Program(863 Program)(No.2006AA020905), Fujian Medical Innovation Program(No.2009-CXB-55).

Corresponding author:Yixin Chen.Tel: +86-592-2188393; Fax: +86-592-2181258; E-mail: yxchen2008@xmu.edu.cn*These authors contributed equally to this work.国家高技术研究发展计划(863计划)(No.2006AA020905)，福建省医学创新课题(No.2009-CXB-55)资助。