自体骨髓及纤维蛋白胶在骨组织工程中的应用现状

姚旺祥 马 安

(1.杭州市第一人民医院,浙江 杭州 310006;2.浙江省医学科学院,浙江 杭州 310013)

因创伤、肿瘤所致的骨缺损、骨不连的治疗一直是骨科研究的重要内容。传统的自体骨移植由于其来源有限且增加创伤使其应用受到一定的局限,单纯使用同种异体骨及人工骨则有成骨能力受限、费用高等缺点[1]。骨组织工程的发展为解决问题带来了新的希望。使用体外培养的细胞有培养时间长、难以及时使用等缺点,而若通过浓缩骨髓基质干细胞,则可以及时获得治疗浓度的细胞,一次操作解决问题[2]。应用临床广泛使用的纤维蛋白胶作为支架,具有便宜、易得等优点,且可有效解决细胞的流失问题,为成骨提供支架而促进成骨。本文就自体骨髓与纤维蛋白胶在骨组织工程中的应用现状作一综述。

1 自体骨髓的应用现状

1.1 自体骨髓的主要成分 骨髓位于骨髓腔中,胎儿及婴幼儿时期的骨髓都是红骨髓,成人红骨髓都分布在扁骨,不规则骨及长骨干骺端的松质骨中。红骨髓主要是由造血组织与血窦构成。骨髓是由造血系统和基质系统组成的复合组织。一系列的实验结果证实了骨髓基质细胞系统中存在能够分化为骨、软骨、脂肪组织的多能干细胞,其在合适的条件下可以生成骨、软骨、肌肉和脂肪及韧带[3]。

松质骨主要由骨髓中的成骨干细胞分化而来,骨髓的成骨能力早就被应用到促进骨折愈合中来,例如在异体骨移植时混合在术中获得的骨髓来增加移植骨的成骨特性[4]。动物实验证明,骨髓中富含骨形成蛋白、基质细胞、骨内膜细胞和骨祖细胞等成分。骨髓中的单核细胞及血小板等能产生各种生长因子,促进骨缺损的修复[5]。

骨髓的成骨能力主要由骨髓基质细胞完成,而骨髓基质细胞具备干细胞的两个重要特征:强的自我增殖能力和多向分化潜能,具有向骨、软骨、脂肪、肌肉(心肌)及神经细胞等组织分化的潜能[6]。骨髓的成骨能力与骨髓中基质细胞的浓度存在正相关,且随着年龄的增长,骨髓基质细胞的成骨活性有所降低[7]。

1.2 自体骨髓在骨组织工程中的应用 近年来已有自体骨髓移植的临床报道,它具有来源广泛、创伤小、采取方便、不受骨不连部位软组织条件的限制、不存在免疫反应、供区与受区并发症少等优点[8]。Finkemeier等[9]观察到骨髓基质细胞可直接转变为成骨细胞。在诱导因子和刺激因子存在的情况下,其他器官组织干细胞亦可转变为成骨细胞,因此,骨髓不仅本身有成骨作用,还可诱导刺激骨不连处其他器官组织细胞转变为成骨细胞,大大提高了局部成骨能力。

Bruder等[10]采集大鼠、犬和人骨髓中的骨髓基质细胞在体外培养扩增后,种植于羟基磷灰石和磷酸三钙支架材料,复合后分别将其植入同基因的鼠、犬和去胸腺大鼠体内,成功地修复了标准的股骨干骨缺损。Owen等[11]将骨髓细胞悬液种入扩散盒,植入动物体内,发现有骨形成,由于扩散盒能够阻挡植入部位周围细胞及血管的长入,故其成骨作用不依赖于周围组织。扩散盒的组织由纤维组织向软骨组织和骨组织转变,与胚胎骨发生过程十分相似。以上研究结果证明了骨髓中存在着不依赖于原有骨髓环境,能够独立成骨的骨祖细胞成分。

1.3 自体骨髓及其提取物在临床的应用 Quarto等[12]报道采用自体髂骨穿刺抽取骨髓,分离培养骨髓基质细胞,经体外扩增后复合羟基磷灰石修复3例四肢长骨缺损,采用外固定支架固定。经术后随访,1例右胫骨4.0cm的缺损在术后27个月、1例右尺骨远端4.0cm缺损在术后16个月、1例右肱骨7.0cm缺损在术后15个月时均获得功能恢复。柴岗等[13]利用骨髓基质细胞体外诱导为成骨细胞后,与同种异体部分脱钙骨复合修复颅颌面骨缺损病11例,术后1～2.5年的随访表明组织工程骨稳定存在,无明显骨吸收现象,临床治疗效果稳定。

Connolly等[7]报道用自体骨髓注射成功治疗20例胫骨骨不连,证实了自体骨髓的成骨作用。Hernigou等[14]将自体骨髓通过细胞分离器浓缩后注射入胫骨萎缩性骨不连患者,证明其有效性与移植骨髓中基质细胞的数量有关,不经浓缩处理,其基质细胞数量并不能达到治疗骨不连的理想数目。干耀恺等[15]利用富集骨髓基质细胞技术,通过局部注射或与多孔磷酸三钙材料复合后回植治疗骨缺损患者49例,证实富集骨髓干细胞技术是一种快速、安全、简便的临床细胞治疗手段。这些研究表明,骨髓基质细胞复合适宜材料进行移植可修复骨缺损,骨髓基质细胞复合材料的成骨能力明显优于单用材料或单用骨髓基质细胞,因为材料提供细胞生长的支架而不让其流失[16]。

在临床工作中,使用骨髓基质细胞应严格遵守细胞移植治疗的适应证及禁忌证,遵守我国《药物临床试验质量管理规范(2003)》制定的全部准则,谨慎地在较大型的三级甲等医院,并经医院伦理委员会同意,进行临床实验,为广大患者服务。

2 纤维蛋白胶在临床及组织工程技术中的应用

2.1 纤维蛋白胶的主要成分及理化性质 纤维蛋白胶(Fibrin Glue,FG)是利用哺乳类动物或人的血液中有关成分,通过人工提取而来。FG由两部分组成,第一部分为浓缩纤维蛋白原、XIII因子和抑肽酶,其中纤维蛋白原含量与凝固的强度、凝固时间直接相关,而XlII因子可以促进未分化的间充质干细胞的增殖及分化;第二部分含凝血酶和氯化钙。两者混合后凝血酶酶切纤维蛋白原,释放出纤维蛋白A肽及B肽,促进纤维蛋白原转化为纤维蛋白,形成纤维蛋白单体,凝血因子使纤维蛋白分子交联,聚合成网状,增加凝集强度。凝血酶在钙离子存在下参与纤维蛋白多肽的交联,使之形成坚固的不易降解的凝块[17]。

在体内纤溶酶作用下,通常纤维蛋白在体内的降解时间在2～3周左右[18]。纤维蛋白胶内不同的组成成分,如纤维蛋白原、凝血酶的浓度、离子强度等都能够影响纤维蛋白胶的稳定性及其内部结构。堵疾等[19]研究发现,通过在FG中加入不同浓度抑肽酶、氨基酸类化合物,可以调节控制其降解时间。氨基酸类化合物抗纤溶作用机制主要是抑制纤溶酶原与纤维蛋白的结合,由于氨基酸类化合物结构与赖氨酸相似,从而竞争性抑制了纤溶酶原与纤维蛋白的结合,影响其激活,使之不受纤溶作用而溶解;此外,此类氨基酸类化合物也抑制了纤溶酶活性的作用,保护某些凝血因子,免受纤溶酶的降解。

纤维蛋白在创伤愈合中是一种天然的细胞生长支架材料,从创伤开始发生凝血、纤维蛋白支架形成后就开始为多种细胞,如成纤维细胞、角质形成细胞和内皮细胞提供迁移至创伤部位的途径[20]。在整个创伤愈合过程中,纤维蛋白不仅是支架材料,还有许多生物活性功能,如吸引和激活血细胞、促进血小板黏附等。

FG有良好的组织相容性,生物降解性,能较好地介导细胞信号传导和细胞间相互作用,可降解并释放β转化因子和血小板衍生生长因子促进细胞粘附和增殖,为细胞提供三维空间,促进组织再生[21]。天然网状结构,长期稳定的纤维蛋白胶是细胞生长和分泌特异性基质的必要条件。如果纤维蛋白胶降解吸收过快或其纤维网状结构过于紧密则会抑制细胞增殖与迁移,影响细胞外基质的形成。

2.2 纤维蛋白胶在骨组织工程中的应用 现已广泛用于外科临床的PG是从全血中分别提取出纤维蛋白原和凝血酶后分开包装的一种可注射型制剂。使用时将两者混合注入机体内。纤维蛋白胶可用于减少根治性乳房切除术和肿块切除术后血肿的形成,同时该制剂可用于粘合手术缝合处。纤维蛋白胶在欧洲的临床应用指症是止血、组织粘合、促进缝合创口的愈合、封闭体内空腔和蛛网膜下隙等[17]。

研究发现FG不仅具有封闭创面、止血、促进愈合、生物粘合等多种功能,还因其特有的纤维蛋白网状结构使其可作为药物缓释载体[22]。FG作为骨形态发生蛋白的载体进行骨缺损修复研究发现,两者复合物的骨修复能力明显大于单一成分[23]。Naif等[24]的研究证实FG能增加骨髓基质细胞的黏附率并显著促进其增殖。由于纤维蛋白胶在成型之前两种成分都是液体成分,具有可以任意塑型的特点,聚合后通过凝胶状纤维网状结构特点发挥支架作用,作为一种可注射性细胞支架材料目前已经在组织工程学领域得到广泛应用[25]。

FG本身也是一种优良的骨修复材料,凝固后独特的三维结构使其为细胞的黏附提供了支架。Pei等[26]取自体膝关节滑膜细胞与纤维蛋白胶复合后旋转培养1个月,见细胞保持原有形态,将其与材料复合后成功修复了兔股骨髁的骨软骨缺损。Tayapongsak等[27]在下颌骨重建术中,将患者自体纤维蛋白黏合剂注入到骨移植区,发现骨修复速度明显加快。Isogai等[28]将培养后的牛骨膜细胞与FG混合植入裸鼠背部皮下,12周时有新骨形成,而单纯FG植入无新骨形成。

Abiraman等[29]的实验进一步证实FG可能有骨诱导活性,他们将PG包被羟基磷灰石颗粒,生物活性玻璃陶瓷和磷酸钙硅酸钙系统分别植入鼠股四头肌,以未包被材料作为对照,结果表明FG可能有骨诱导作用。纤维蛋白胶的降解作用有利于组织的愈合,复合的细胞及细胞因子的释放,从而与成骨同步起来[30]。另外FG可以促进形成新的毛细血管及胶原沉积,这也将有利于骨形成[31]。

总之,浓缩自体骨髓含有成骨细胞、丰富的成骨因子,可及时使用,而纤维蛋白胶则可提供细胞附着的支架,将两者结合,可望为骨缺损的治疗提供新的思路。

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