急性胰腺炎动物模型不同造模方法与肠道细菌易位的关系

许娟娟 刘俊 侯晓华

·综述与讲座·

急性胰腺炎动物模型不同造模方法与肠道细菌易位的关系

许娟娟 刘俊 侯晓华

重症急性胰腺炎(SAP)是病死率极高的病症之一。由于其病因、发病过程、病变程度等因人而异，治疗措施的研究也受到限制，故目前关于SAP的研究更多地依赖于急性坏死性胰腺炎(ANP)动物实验。1986年Beger等人提出肠道细菌易位是引起胰腺组织坏死性感染的主要原因[1]。肠道动力改变所伴随的肠道菌群变化、肠屏障受损以及免疫应答紊乱被认为是SAP肠道细菌易位的三个重要环节。不同的动物模型影响着肠道细菌易位的不同环节，而且造模技术本身也会影响肠道细菌易位[2]，所以了解各种ANP动物模型的特点对于更有效地研究SAP肠道细菌易位具有相当重要的意义。

一、已证实影响肠道细菌易位的ANP模型

1．胰胆管注射法：经胰胆管内注射胆汁、有菌或无菌的胆盐以及激活的胰酶均能诱发ANP，最常用的是牛磺胆酸钠。该模型可破坏胰管黏膜屏障，引起胰腺水肿、自溶、血流量降低，乃至胰腺实质坏死。实验大鼠的死亡率与药物浓度、注射量及注射压力均有关[3]。Aho等[4]在大鼠胰管内注射3%、4.5%或5%的牛磺胆酸钠0.2 ml/kg体重，前两种浓度的动物72 h死亡率分别为23.5% 和71.4% ，而5%浓度者在31 h内全部死亡。采用定时定量装置准确地控制注射压力和速度，同一批实验动物胰腺坏死程度相差无几；如果压力不加控制，不同课题之间所诱导的急性胰腺炎(AP)严重程度会有很大的差异。有实验研究报道，大鼠胰管所能承受的最大压力为30～50 mmHg(1 mmHg=0.133kPa)。

虽然此造模技术具有迅速和可重复性的优点，但是它会影响肠道细菌易位，除了手术过程中抓捏小肠会潜在性地影响黏膜屏障功能外，细菌可因十二指肠乳头穿刺经乳头移行入胰胆管以及潜在性地进入腹腔[5]。此模型成功的关键在于：严格无菌操作，减少因腹膜感染对模型的影响；找到胰胆管在十二指肠处的开口，并准确逆行注射，争取进针一次成功；造模后严密观察动物，防止其舌根后坠或分泌物堵塞气道引起的意外死亡。

2．雨蛙素灌注法：由Lampel和Kern于1977年首次报道[6]。灌注低剂量的雨蛙素(胆囊收缩素和胃泌素的类似物)可在不引起细胞坏死的情况下提高胰腺的外分泌功能，并使胰蛋白酶原在胰腺内激活，引起急性水肿性胰腺炎，与人类轻症急性胰腺炎相似。雨蛙素所诱导的AP特点是病变较轻、重复性好，因此成为轻型AP和缺血对胰腺的影响以及水肿性胰腺炎转变为坏死性胰腺炎机制研究的常用模型，也可用于氧自由基清除剂治疗ANP效果的研究[7]。

需注意的是雨蛙素会降低肠道动力从而影响肠道细菌易位。有研究显示，它可使肠道传导时间延长，小肠动力降低，导致小肠细菌过度生长，并且向肠外易位增加[8]。因此，雨蛙素会通过改变肠道动力来干扰肠道细菌易位。

3．胰胆管注射和雨蛙素刺激：Schmidt等[9]报道，经大鼠胰胆管联合注射胆盐和雨蛙素诱导SAP模型，比其他模型更能模拟人的胰腺炎疾病过程[10]，是“一种能更好评估疗效的模型”。虽然它被证实是一种非常有价值的模型，但是它具有逆行胰胆管注射法和雨蛙素注射法双重的缺陷，在分析结果时还是必须考虑造模相关的干扰因素。

4．胰管结扎法：此模型通过阻止胰腺分泌物顺利流出及胆汁反流入胰管诱导胰腺炎，以水肿、轻微的炎症和少量的腺泡坏死为特点。但在美国负鼠中应用此法造模可诱导ANP[11]。

由于胆汁分泌受阻可导致小肠细菌的过度生长和细菌的易位，胰蛋白酶缺乏会改变肠道的通透性，阻塞所致的黄疸也导致免疫系统的受损，这些均可干扰实验结果[12]。

5．十二指肠闭襻法：该法是结扎胆总管开口远近各1 cm的十二指肠，24 h后胰腺出现水肿，胰头部出血和胰周脂肪坏死。其机制是十二指肠腔内压力增高，使胆汁反流入胰管，胆汁破坏了胰管上皮的黏膜屏障，反流入胰管的胆汁卵磷脂被胰液的磷脂酶A2分解为可破坏细胞膜和导管的溶血卵磷脂，胰内蛋白酶激活，导致胰腺水肿、出血和坏死。本模型主要用于研究ANP的发病机制[13]，因动物多死于肠坏死，故较少用于治疗性研究。

该模型的病情有很大的多变性。胃肠管道的不连续性可导致黏膜萎缩和屏障功能的改变[14]；胆汁流向肠道受阻会导致肠道动力的降低，小肠细菌过度生长增加了肠道细菌易位的可能[15]；十二指肠内容物反流，包括细菌可逆行进入胰胆管。因此，限制了其在研究肠道细菌易位中的应用。

6．饮食诱发：Farber和Popper等[16]于1950年给小鼠服用乙硫氨酸诱发出ANP。1975年Lombardi等[17]应用缺乏胆碱的乙硫氨酸(CDE)饮食诱发雌性小鼠ANP和脂肪坏死。其机制为乙硫氨酸在体内能与甲硫氨酸相拮抗，干扰胰腺蛋白质和RNA的代谢，造成胰腺腺泡的损伤，其病变的形态学与人类SAP十分类似。动物死亡率与饲喂CDE的时间有关。饲喂CDE食物4 d的死亡率为100%；仅饲喂1 d，则死亡率为66%。人们可以通过改变饲喂CDE的时间，将死亡率控制在理想的范围内。

由于此模型会出现全身并发症，如腮腺炎和脂肪肝，使得它在研究SAP的全身反应免疫应答中较少应用[18]。另外，此模型胰腺感染的发生概率太低，很难进行手术介入一类的治疗干预研究，同时CDE食物在国内不易获得。这些均制约了它在AP肠道细菌易位中的应用[19]。

二、未证实是否会影响肠道细菌易位的ANP模型

1．L-精氨酸注射法：Tani等首次报道大鼠腹腔内注射过量L-精氨酸(50 μg/10 kg大鼠体重)后导致大鼠血清淀粉酶及脂肪酶升高，胰腺变性坏死，证明腹腔内注射过量L-精氨酸能诱导大鼠ANP模型。此法制备简单，可重复性好，但目前还未发现其对肠道细菌易位的影响。

2．高钙血症法：1990年Frick给猫灌注葡萄糖酸钙(0.6 mmol·kg-1·h-1)，提高胰腺局部血钙水平，诱发出血坏死性胰腺炎。在外周持续性灌注同剂量葡萄糖酸钙也可诱发典型的ANP。1994年Frick又给雌性大鼠(300～400 g)尾静脉滴注CaCl2(0.6 mmol·kg-1·h-1)，持续12 h。组织学检查发现在胞质内有酶原颗粒聚集，胞质空泡化，腺泡坏死水肿，失去极性[20]。机制是与高血钙引起胰腺损伤及Ca2+在细胞内过量积聚有关。PLA2可降解膜磷脂生成具有生物活性的溶血卵磷脂，引起膜结构排列紊乱和功能障碍。一旦溶酶体膜受损或可释放Cathepatin B，后者能直接激活胰蛋白酶原，该酶再激活其他酶原，引起细胞自身消化。此外，当细胞内Ca2+异常升高时还能引起线粒体功能障碍，ATP合成减少，依赖ATP的离子泵功能丧失，最终导致细胞死亡。高血钙诱发的ANP模型主要用于对其病因学的研究。但还未证实会影响肠道细菌易位。

3．动脉注射微球：1862年Panam及Pfeffer将微球注入血液循环中诱发出出血性胰腺炎。近年Redha等将20 μm塑料微球注入大鼠脾动脉供胰分支，27 h后出现急性出血性胰腺炎。本模型主要用于研究缺血对胰腺的影响，以揭示缺血在SAP发病中的作用，同样也未发现此模型对肠道细菌易位的影响。

三、结语

纵观各种ANP造模技术与肠道细菌易位的关系，可以发现目前很多常用的ANP造模技术可通过影响肠道动力、损害肠黏膜屏障及影响机体免疫功能三个环节中的某个方面干扰肠道细菌易位。另外，外科操作本身也会增加假阳性概率，因此我们应排除选用统一的ANP动物模型的观点，而要根据不同的实验目的选用不同的动物模型。

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2009-04-06)

(本文编辑：屠振兴)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.03.030

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