大黄甘草汤单煎液与合煎液中蒽醌类化合物和甘草酸煎出量的变化

王 彬， 韩 刚， 张学俊， 翟冠玉， 范 颖

(1.贵州大学生命科学学院，贵州贵阳550003;2.华北煤炭医学院药学系，河北 唐山063000;3.贵州大学化工学院，贵州贵阳550003)

大黄甘草汤出自《金匮要略》，该方主治便秘，由大黄为主，配甘草组成。大黄通滞泻下、清热解毒，甘草补中益脾、润燥缓急。二者配伍用苦寒与甘平相结合，能清、能下、能通，解毒而不伤正。但大黄性味苦寒，攻势峻猛。甘草味甘性平，有益气补中，缓急止痛，调和药性的作用。研究表明［1］，甘草酸能阻止单用大黄引起的结肠剧烈收缩，缓解腹泻开始时的腹痛。

近年来中药免煎颗粒剂在临床上被广泛采用。中药免煎颗粒是以符合炮制规范的优质药材为原料，按照中药制剂制法，选用适当的溶媒和工艺，将中药饮片中可溶性有效成分浸出，经浓缩、干燥、制粒等工序制成的单味药颗粒。患者在服用时按处方将单味药颗粒剂混合服用，与传统汤剂相比具有免煎易服、携带方便等优点。但中药复方中所含成分复杂，单煎与合煎时化学成分产生的相互作用不同，各成分溶出度量不同。

蒽醌类化合物为大黄泻下的主要成分［2－3］(包括游离型和结合型)，甘草的主要成分为甘草酸。中药复方汤剂在煎煮过程中各味药的成分会相互作用，使复方中的有效成分的溶出率发生变化。本实验采用 RP－HPLC法，测定了大黄甘草汤单煎与合煎液中主要有效成分蒽醌类化合物与甘草酸的煎出量的变化，为大黄甘草汤颗粒剂的研制提供实验依据，为研究中药复方配伍提供参考。

1 仪器与试药

1100型高效液相色谱仪(美国Angilent公司，四元梯度泵，手动进样，Angilent工作站);KDC21042低速离心机(科大创新公司);AE240十万分之一电子天平(瑞士Mettler公司)。大黄酸、大黄素、大黄酚、芦荟大黄素对照品(中国药品生物制品检定所提供);甘草酸对照品(西安富捷药业有限公司，甘草酸含量＞98.9%);色谱纯甲醇(Fisher公司)，其余试剂均为分析纯。甘草饮片(产地:新疆)，大黄饮片(产地:甘肃)，均购自唐山市药材公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

2.1.1 蒽醌类化合物的测定条件:色谱柱:Angilent公司Zorbox SB C18(150 mm×4.6 mm);流动相:甲醇 －水－冰醋酸(77 ∶22 ∶1);检测波长:428 nm;流速:1.0 mL/min;柱温:室温［4－5］。此条件下芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚分离良好。见图1。

图1 大黄甘草汤中蒽醌类化合物色谱图

2.1.2 甘草酸的测定条件:色谱柱:迪马C18(250 mm×4.6 mm);流动相:甲醇－水－冰醋酸(83.5∶15∶1.5);检测波长:254 nm;流速:1.0 mL/min;柱温:室温。此条件下甘草酸分离良好。见图2。

2.2 方法学研究

2.2.1 对照品贮备液的制备 精密称取芦荟大黄素1.99 mg、大黄酸 2.18 mg、大黄素 2.03 mg、大黄酚 2.06 mg，置于10 mL量瓶中，以甲醇定容，摇匀，即为蒽醌对照品贮备液。精密称取甘草酸对照品1.00 mg，置于10 mL量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度得甘草酸对照品贮备液。

图2 大黄甘草汤中甘草酸色谱图

2.2.2 线性关系的考察 分别精密量取对照品贮备液0.10、0.20、0.30、0.50、0.80、1.00 mL，置于 10 mL 量瓶中，甲醇定容，20 μL进样测定。以蒽醌标准溶液浓度X对色谱峰面积Y进行线性回归，得蒽醌类化合物的线性回归方程。结果见表1。分别精确量取甘草酸对照品贮备液1.00 mL，依次用甲醇稀释至 50、25、10、0.5、0.1 mg/L，按上述色谱条件，分别依次进样20 μL测定。以甘草酸的浓度X对其峰面积Y进行线性回归，得回归方程，结果见表1。

表1 线性回归方程

2.2.3 精密度试验 取同一浓度的对照品溶液连续进样5次，测定峰面积，计算RSD，芦荟大黄素为1.59%，大黄酸为0.71%，大黄素为0.72%，大黄酚为0.81%，表明该方法精密度良好。

2.2.4 重复性实验 对同一提取液，按2.4项下样品制备方法平行制备5份样品溶液，测定峰面积，计算RSD，芦荟大黄素为1.59%，大黄酸为1.79%，大黄素为1.01%，大黄酚为1.95%。

2.2.5 稳定性试验 取同一样品溶液于室温下0、2、4、6、8、10 h分别进样，测定峰面积，计算RSD，芦荟大黄素为1.08%，大黄酸为 2.00%，大黄素为1.47%，大黄酚为1.20%，结果表明，样品溶液在10 h内稳定。

2.2.6 回收率试验 精密量取同一水煎液样品6份，其中5份分别精确加入对照品，另一份作为测定本底值样品用，各份均按2.4项下方法制备样品，进样20 μL测定峰面积，计算回收率，结果见表2。

表2 回收率试验

2.3 大黄甘草汤单煎液与合煎液的制备

2.3.1 大黄单煎液的制备 称取大黄4.0 g待用。于回流装置中加入药材量20倍的水加热至沸，下大黄，回流提取25 min后离心，即得大黄单煎液。

2.3.2 甘草单煎液的制备 称取甘草1.0 g待用。于回流装置中加入药材量20倍的水加热至沸，加入甘草回流提取40 min后离心，上清液为甘草1 g单煎液。同法制备甘草2 g单煎液、甘草4 g单煎液、甘草6 g单煎液。

2.3.3 大黄甘草汤合煎液的制备 按处方比例准确称取大黄4.0 g，甘草1.0 g待用。于回流装置中加入药材量20倍的水加热至沸，下甘草，回流提取15 min后，下大黄，再回流提取25 min后离心，即得大黄甘草汤4∶1合煎液。称取大黄4.0 g，甘草2.0 g，按上述方法操作，即得大黄甘草汤4∶2合煎液。称取大黄4.0 g，甘草4.0 g，按上述方法操作，即得大黄甘草汤4∶4合煎液。准确称取大黄4.0 g，甘草6.0 g，按上述方法操作，即得大黄甘草汤4∶6合煎液。

2.4 供试品中各成分含量测定

2.4.1 游离蒽醌的测定［6］精密量取各煎液5.00 mL于回流装置中，加水10 mL，加氯仿水浴回流提取3次(0.5 h，20 mL;0.5 h，20 mL;0.5 h，10 mL)，分取氯仿层，合并氯仿提取液，水浴蒸干溶剂，残渣用适量甲醇溶于10 mL量瓶中，以甲醇定容，得游离蒽醌供试品。过0.45 μm微孔滤膜后，20 μL进样测定，结果见表3。

表3 甘草对合煎样品中蒽醌类化合物溶出的影响

2.4.2 总蒽醌的测定［6］精密量取大黄提取液5.00 mL于回流装置中，加水10 mL，浓盐酸2 mL(使结合蒽醌水解为游离蒽醌)，加氯仿水浴回流提取3次(1 h，20 mL;1 h，20 mL;0.5 h，10 mL)，分取氯仿层，合并氯仿提取液，水浴蒸干溶剂，残渣用适量甲醇溶解于10 mL量瓶中，以甲醇定容，得总蒽醌供试品。过0.45 μm微孔滤膜后，20 μL进样测定。结合型蒽醌含量=总蒽醌含量－游离型蒽醌含量。结果见表3。

2.4.3 甘草酸含量测定 样品液过0.45 μm微孔滤膜后，20 μL进样测定。结果见表4。

表4 大黄对合煎液中甘草酸溶出的影响

3 讨论

3.1 实验结果显示大黄单煎及大黄甘草不同比例配伍后合煎，总蒽醌类化合物煎出量基本保持恒定，说明在大黄甘草汤中甘草对大黄中蒽醌类化合物煎出量影响不大。

大黄与甘草配伍合煎时，甘草酸的煎出量却发生了明显的变化，合煎后煎煮液中甘草酸的含量均比单煎时得含量有明显提高。按经典方剂中大黄与甘草4∶1比例配伍合煎时，甘草酸的溶出量是单煎时的2.7倍。我们认为，大黄甘草合煎液中甘草酸含量的提高可能是因为合煎过程存在助溶作用，从而提高了甘草酸溶出率，是否有其它原因，有待进一步研究。甘草与大黄的比例量的从4∶1提高到4∶6，甘草酸的溶出率逐渐趋近于单煎时的溶出率。然而按经典方剂的4∶1比例煎煮，可达到每克甘草溶出17.54 mg，高于其他配伍比例，实验结果说明大黄和甘草合煎优于单煎。大黄甘草汤中药免煎颗粒剂的制备应采用大黄与甘草合煎的方式，可以大大地提高甘草酸的含量，节省甘草的用量，而此时大黄中的蒽醌类化合物的溶出量不会发生改变，保证了大黄甘草汤的药效。

3.2 近年来，中药免煎颗粒在医疗机构的广泛使用，引起了学术界的争议，而争议的焦点为“中药合煎与单煎的差异性”。中药复方并不是一个或几个单体的简单相加。本实验证明大黄甘草汤使用时或制成颗粒剂时应采用大黄与甘草合煎的方式制备，否则会降低甘草酸的含量，影响大黄甘草汤的药效。

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