女贞子总黄酮对高脂模型小鼠脂代谢的分子靶点的研究

曹兰秀， 周永学， 顿宝生， 赵 娴

(陕西中医学院方剂教研室，陕西咸阳712046)

女贞子(Fructus Ligustri lucidi)为木犀科植物女贞(Ligustrum lucidum Ait)的干燥成熟果实，其性味甘苦、凉，入肝、肾经，具有滋补肝肾、明目乌发之功效［1］。有报道［2－3］，女贞子具有明显的降脂作用，总有效率达91.2%。实验研究［4］发现女贞子总黄酮(Total Flavonoid in Ligustrum Lucidum Ait，TFL)具有降低血脂，软化血管，降血糖等作用，但女贞子降脂作用多见于临床报道，本实验采用Triton－WR1339诱导的高脂模型小鼠，观察女贞子总黄酮的降脂作用，进一步对其肝组织脂代谢相关因子的转录水平进行检测，为阐释其降脂机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物与制备 女贞子总黄酮(TFL)，由陕西中医学院中药研究所提供，总黄酮含量98%，苯扎贝特(青岛双鲸制药厂)。

1.1.2 试剂与设备 总胆固醇(TC)，甘油三脂(TG)，高密度脂蛋白(HDL－C)，低密度脂蛋白(LDL－C)试剂盒(北京中生生物高技术公司)，Triton－WR1339，焦碳酸二乙酯(DEPC)，溴化乙锭(EB)和琼脂糖(美国sigma公司);Trizol(美国Invitrogen公司)，MMLV第一链cDNA合成试剂盒及一步法PCR试剂盒(美国Promega公司)，DNA Marker II、引物(上海生工生物工程技术服务有限公司)。

仪器设备:TC－52/H型基因扩增仪(Bioer)，FR 200A全自动紫外与可见分析装置(上海复日科技有限公司)，DYYIII－5型水平电泳仪(上海分析仪器厂)。

1.2 方法

1.2.1 高脂模型的制备与分组 ICR小鼠(西安交大实验动物中心)，♂性，随机分为6组(n=10)，分正常对照组，模型组，阳性药组(苯扎贝特100 mg/kg体重)，TFL大剂量组(300 mg/kg体重)，TFL中剂量组(150 mg/kg体重)，TFL小剂量组(75 mg/kg体重)。各组灌胃给药3 d，正常对照组和模型组给予同体积蒸馏水。第4天，动物禁食过夜。灌胃给药后立即对给药组和模型组小鼠腹腔注射 Triton－WR1339(400 mg/kg体重)，正常对照组腹腔注射等体积生理盐水。以腹腔注射Triton－WR1339为起始时间，分别于时间点12 h和36 h连续给药2次。在造模给药后的第36小时眼眶采血，立即处死，取肝组织用于脂代谢因子实验。

1.2.2 总胆固醇(TC)，甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL－C)和低密度脂蛋白(LDL－C)水平检测 按试剂盒说明书进行操作。

1.2.3 RT－PCR 检测肝组织 PPARα，LPL 和 HMG－CoA 还原酶mRNA表达量①总RNA的提取:按照Trizol说明书操作方法操作，将提得总RNA溶解于DEPC处理的水中，测定260 nm和280 nm的紫外吸收值，检测RNA纯度，并计算RNA含量。② 逆转录合成cDNA第一链:按M－MLV逆转录酶说明书进行操作，反应条件:70℃温孵5 min，42℃温孵60 min，70℃加热10 min。③ PCR扩增:取1 μL产物加入25 μL反应体系进行扩增，PCR扩增条件:94℃5 min预变性，94℃45 s变性，55℃30 s，72℃ 1 min聚合，35个循环，72℃ 10 min延伸。引物设计:参照文献方法［5］GAPDH 5′GTATGACTCCACTCACGGCAAA3′ (Forward)， 5′GGTCTCGCTCCTGGAAGATG3′(Reverse)，扩增片段 101 bp;LPL 5′ATCGGAGAACTGCTCATGATGA3′(Forward)，5′CGGATCCTCTCGATGACGAA3′(Reverse)，扩增片段 101 bp;PPARα 5′AGGCTGTAAGGGCTTCTTTCG3′(Forward)，5′GGCATTTGTTCCGGTTCTTC3′(Reverse)，扩增片段 101 bp;HMGCR 5′CATGCAGATTCTGGCAGTCAGT3′(Forward)，5′CGGCTTCACAAACCACAGTCT3′(Reverse)，扩增片段 101 bp。④PCR扩增产物:用1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，用凝胶成像系统及图像分析软件进行成像及分析，结果以各样品条带吸收度对内参GAPDH条带吸收度比值表示。

1.3 统计分析

所有数值表示为Mean±SD，数据用单因素方差分析(ANOVA)，P值小于0.05被视作具有统计学意义。

2 结果

2.1 女贞子总黄酮对Triton诱导的高脂血模型小鼠TC、TG水平的影响

由表1可见，Triton诱导的小鼠模型血脂水平有显著性升高，TG、TC及LDL－C浓度的显著升高。女贞子总黄酮给药血清TC呈现出一定的量效关系。

2.2 女贞子总黄酮对高脂模型小鼠肝组织LPL、PPARα、HMGCRmRNA表达水平 见表2。

凝胶电泳的结果中，GAPDH、LPL、PPARα、HMGCR 均有较明显的条带。以GAPDH的含量为内标，比较各组样品目的基因的转录水平，发现模型的LPL与PPARα的转录水平较正常对照有显著下降(P＜0.05);而女贞子总黄酮则起到了较明显的上调作用。

表1 女贞子总黄酮对高脂模型小鼠TC、TG、HDL-C，LDL-C水平的影响(±s，n=10)

表1 女贞子总黄酮对高脂模型小鼠TC、TG、HDL-C，LDL-C水平的影响(±s，n=10)

与空白对照组比较，*P＜0.05，**P ＜0.01;与模型组比较，#P＜0.05，##P ＜0.01。(下同)

分 组 TC/(mg/dl) TG/(mg/dl) LDL－C/(mg/dl) HDL－C/(mg/dl)正常组128.0±12.0 167.1±23.8 98.3±20.9 69.9±8.8模型组 293.2±14.1** 243.8±14.5* 164.7±12.4* 71.7±3.5苯扎贝特100 mg/kg 86.2±12.9# 207.6±23.5 95.7±3.8# 74.2±9.2 TFL 75 mg/kg 160.8±12.9 215.7±28.0 134.6±18.3 73.5±15.5 150 mg/kg 134.1±6.4# 180.0±20.1# 123.9±28.5 85.0±8.5 300 mg/kg 126.6±3.8## 177.0±18.4# 91.6±16.4#83.6±16.4

表2 女贞子总黄酮对高脂模型小鼠肝组织LPL、PPARα、HMGCRmRNA表达水平的影响(±s，n=6)

表2 女贞子总黄酮对高脂模型小鼠肝组织LPL、PPARα、HMGCRmRNA表达水平的影响(±s，n=6)

分 组 LPL PPARαHMGCR正常组0.93±0.15 0.71±0.15 0.42±0.20模型组 0.68±0.06* 0.26±0.05* 0.86±0.24苯扎贝特100 mg/kg 0.78±0.07 0.56±0.14# 0.65±0.15 TFL 75 mg/kg 0.87±0.21 0.33±0.20 0.60±0.06 150 mg/kg 1.09±0.19# 0.34±0.06 0.61±0.03 300 mg/kg 1.31±0.33# 0.53±0.01#0.45±0.05

3 讨论

腹腔注射Triton WR－1339(tyloxapol，简称 Triton)可造成明显的高脂血模型。女贞子总黄酮对Triton诱导的高脂模型小鼠给药后，可明显降低 TC，TG，LDL－c，对于调节脂代谢紊乱具有明显作用。

LPL是脂肪细胞分化的一个早期参考性标志，是甘油三酯降解为甘油和游离脂肪酸反应的限速酶［7］。LPL的表达受PPAR信号通路的调控［8－10］。HMGCR是细胞内胆固醇合成限速酶。抑制其活性可导致细胞内胆固醇水平减少［11］。实验结果表明，女贞子总黄酮能显著性增加LPL的表达，上调PPARα的表达，显著下调HMGCR的表达。因此，女贞子总黄酮可能通过对PPARα－LPL通路以及HMGCR表达的调控来实现其降脂作用。

［1］楼之岑，秦 波主编.常用中药材品种整理和质量研究(北方编)第1册［M］.北京:北京医科大学，中国协和医科大学联合出版社，1995.497－526.

［2］张子臻.女贞子能降血脂、改善心肌供血［J］.中医杂志，1998，39(9)，518.

［3］彭 悦.女贞子降血脂作用的临床观察［J］.辽宁中医，2001，27(10)，23.

［4］卢小沅，陈志良，王春霞.女贞子化学成分及其药理作用研究概况［J］.中药材，2006，29(6):625－628.

［5］Huang C and Qin Y.Berberine inhibits 3T3－L1 adipocyte differentiation through the PPARγ pathway［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，348:571－578.

［6］Tedstone A E，ILIC V，and Williamson D H.Evidence that use of Triton WR1339 underestimates the triacylglycerol entry micee into the plasma of lactating mice owing to continued accumulation of lipid in the mammary gland［J］.Biochem J，1990，272:835－838.

［7］杜纪坤，黄青阳.脂蛋白脂酶基因的研究进展［J］.遗传，2007，29(1):8－16.

［8］Sakayama K，Masuno H，Okumura H，et al.Glycosylation of lipoprotein lipase in human subcutaneous and omental adipose tissues［J］.Biochim Biophys Acta，2002，1127(2):153－156.

［9］Mead JR，Cryer A，Ramji DP.Lipoprotein lipase，a key role in atherosclerosis［J］.FEBS Lett，1999，462(1－2):1－6.

［10］Goldberg IJ.Lipoprotein lipase and lipolysis:central role in lipoprotein metabolism and atherogenesis［J］.J Lipid Res，2006，37(4):693－707.

［11］Holm C.Molecular mechanisms regulating hormone－sensitive lipase and lipolysis［J］.Biochem Soc Trans.2003，31:1120－1124.