云南白药含漱剂对口腔常见细菌抑制作用的体外研究

2010-02-07杨安民杜俊蓉

中成药 2010年10期

杨柳，杨安民，杜俊蓉*

(1.四川大学华西药学院药理学与生物制药学系，四川成都610041;2.中国医药集团四川抗菌素工业研究所药理部，四川成都610052)

口腔通过嘴与外界相同，口腔内部温度恒定，湿度高，有许多狭窄的地方可形成厌氧环境，还有食物剩渣和老化坏死的细胞作为细菌的营养来源，是微生物生长的理想环境。据统计，在宿主睡觉、谈话、咀嚼和吞咽时，大约可有300－500种细菌进入口腔并进行繁殖生长。口腔中的细菌、真菌等微生物大部分是有益菌，它们组成一个稳定的生态系统，这个生态系统的稳定性对口腔内的卫生非常重要。但若口腔卫生条件不良、机体免疫力下降，菌群平衡失调，致病菌株过度繁殖则可能引发系列疾病。口腔常见疾病如龋齿、牙龈炎、牙周炎、牙龈脓肿、牙齿松动等都与口腔致病菌密切相关。甚至口腔中一旦出现微小伤口，致病菌还可随着血液循环到达身体其他地方，引起关节炎，心内膜炎等疾病［1］。云南白药是我国的传统中药，主要由三七、冰片、麝香等组成。其在民间用于治疗外伤、出血、跌打损伤等已有超过百年的历史，而现代医学研究正不断地挖掘着古老药物的新药理作用［2］。在我们的前期观察中发现云南白药对某些致病菌株有抑菌作用，故于本次试验中扩大体外试验细菌谱及细菌株数，进一步观察云南白药含漱剂的体外抑菌作用。

1 材料与试剂

1.1 药物的制备和用法

云南白药浸膏(批号20070201)及空白溶剂(批号20070201)，由云南白药集团股份有限公司提供。浸膏为深棕色黏稠液体，每克云南白药浸膏相当于生药量2.82 g。空白溶剂为透明无色澄清液体，有特殊香气。使用前先用无菌双蒸水将空白溶剂1∶4稀释，再用稀释后的溶剂溶解稀释浸膏至所需浓度药物。

1.2 试验菌株

1.2.1 需氧菌包括:普通金黄色葡萄球菌(6株)、金黄色葡萄球菌甲氧西林耐药菌(MRSA，10株)、金黄色葡萄球菌甲氧西林敏感菌(MSSA，14株)、表皮葡萄球菌甲氧西林耐药菌(MRSE，11株)、表皮葡萄球甲氧西林敏感菌(MSSE，5株)、大肠埃希菌(7株)、肺炎克雷伯菌(8株)。

1.2.2 厌氧菌包括:变形链球菌(4株)、唾液链球菌(1株)、口腔链球菌(1株)、变黑普雷沃菌(1株)、中间普氏菌(1株)、脆弱拟杆菌(1株)、伴放线放线杆菌(2株)、具核酸杆菌(1株)、黏性放线菌(1株)、牙髓卟啉单胞菌(4株)、内氏放线菌(1株)、栖牙普氏菌(1株)、衣氏放线菌(1株)。

1.2.3 真菌包括:白色念珠菌(10株)、热带念珠菌(2株)。

需氧菌菌株均为2005年10月至2007年5月于四川等地区三级甲等医院的住院患者的各种体液标本中分离的病原菌(由北京国家耐药性检测中心提供的四川地区临床分离菌株及四川川北医学院等单位提供)。厌氧菌菌株均为2007年5月由四川大学华西口腔医院微生物教研室提供;真菌为2007年5月由中国国家临床检验中心提供。所有菌株在分离单位经自动细菌鉴定仪(VTITEK2，VTITEK32)及Phoenix100药敏分析系统(USA)鉴定，再经本室用常规方法及API系统(法国梅里挨公司)重新鉴定后用于实验。

1.3 培养基

需氧菌选用MH培养基(Gelose Mueller Hinton 2)Biomerieux公司产品，批号:804895301;厌氧菌选用脑心浸液培养基(BRAIN HEART INFUSION AGAR)OXOID产品，批号:391764;真菌选用沙氏培养基，按蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，琼脂18 g，双蒸水900 mL的比例配制，配制完毕后加入2 mg/mL氯霉素水溶液50 mL，定容至1 000 mL，调整pH值至5.6后分装高压灭菌后于4℃保存备用。

2 实验方法

2.1 培养条件

葡萄球菌选用MH培养基，按比例加入2%NaCl，35～37℃孵育18～24 h;其它需氧菌选用MH培养基35℃孵育16～18 h;厌氧菌选用脑心浸液培养基，加入10%无菌脱纤维兔血，0.5%氯化血红素，0.1%维生素K1制成强化布氏琼脂，厌氧环境，35～37℃培养42～48 h;真菌选用沙氏培养基，28℃孵育24～48 h观察记录结果。

2.2 体外抗菌试验方法

2.2.1 最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration MIC)测定:云南白药浸膏等样品对所试菌株MIC值的测定方法采取美国国家临床实验室标准化委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI，即原NCCLs)推荐的琼脂二倍稀释法，按抗微生物药物敏感性试验标准操作规程(Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing)测定各试验药物对试验菌株的最低抑菌浓度(MIC)。受试样品稀释至所需最高浓度，保留2 mL药液，于无菌平皿内加入1 mL药液，剩下的1 mL药液中加入1 mL无菌双蒸水进行对倍稀释，如此方法可将药液进行系列二倍稀释。无菌平皿中再加入融化的50℃ MH培养基14 mL，混匀，待冷却晾干后备用。用多点接种仪(Denley A400，England)接种细菌，需氧菌及真菌的接种菌量约为106CFU/mL，厌氧菌的接种菌量约为108CFU/mL，盖上皿盖。需氧菌置于35～37℃培养箱内培养16～24 h，观察记录结果;厌氧菌置于5%CO2环境35～37℃培养箱内培养42～48 h，观察记录结果;真菌置于28℃培养箱内培养24～48 h，观察记录结果。以平皿内未见细菌生长的药物最低浓度判为最低抑菌浓度(MIC值)。

2.2.2 最低杀菌浓度(minimal bactericidal concentration，MBC)测定:经体外抑菌试验得出药物对各个菌株相应MIC值后，将MIC值以上浓度的药液与试验菌株用上述相同方法再次进行试验，培养后观察，无细菌生长的最低药物浓度为最低杀菌浓度。

2.3 体外抗菌试验药物浓度(mg/L)选择

根据有关同类产品文献报道，以及前期试验所提供的预试验有关实验数据，设定本次实验中云南白药含漱剂对需氧菌的药物浓度按二倍稀释在 1 000、500、250、125、62.5(64)、31.25(32)、15.6(16)、7.8(8)、3.9(4)、2 mg/L 范围内;对厌氧菌的药物浓度按二倍稀释在128、64、32……0.03、0.015、0.005 mg/L范围内;对真菌的药物浓度按二倍稀释在16、8、4……0.06、0.03 mg/L范围内。溶剂对照组对以上菌株得试验浓度均为 1 000、500、250……7.8、3.9、2.0 mg/L。

3 结果

3.1 云南白药含漱剂等受试药物对所试验的需氧菌菌株的体外抗菌试验结果见表1，对所试验的厌氧菌菌株的体外抗菌试验结果见表2，对所试验的真菌菌株的体外抗菌试验结果见表3。

表1 云南白药含漱剂对需氧菌的体外抗菌试验结果

表2 云南白药含漱剂及溶剂对照对真菌的体外抗菌试验结果

表3 云南白药含漱剂及溶剂对照对厌氧菌的体外抗菌试验结果

3.2 结果分析:在本实验室条件下，此次所试验的云南白药含漱剂，对所试验的需氧菌、厌氧菌及真菌表现出了较好的体外抗菌活性。尤其对口腔的重要致病厌氧菌如牙龈卟啉单孢菌、伴放线放线杆菌等有良好的体外抗菌活性。对所试验的4株牙龈卟啉单孢菌 PgATCC35406、Pg381、Pg47A－1、Pg981的MIC分别为16、16、16、1 mg/L;对所试验的2株伴放线放线杆菌ATCC29523、ATCC29522的MIC值分别为16、0.5 mg/L。对其他口腔重要致病厌氧菌如变黑普雷沃氏菌、具核酸杆菌、脆弱拟杆菌、放线菌属菌株、唾液链球菌等都有较好的体外抗菌活性，MIC值大多在16～32 mg/L。对口腔中的变形链球菌体外抗菌活性稍弱，MIC为128 mg/L。

云南白药含漱剂对口腔中常见的需氧致病菌如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌等都有较好的体外抗菌活性。除少数耐药葡萄球菌以外，对金黄色葡萄球菌MSSA和MRSA的MIC值多在2～32 mg/L之间，对表皮葡萄球菌的MSSE和MRSE的MIC值多在16～32 mg/L之间;对普通金黄色葡萄球菌的MIC值多为32 mg/L;对大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的MIC值多在16～32 mg/L之间。

云南白药含漱剂对口腔中常见的真菌致病菌白色念珠菌有良好的体外抗菌活性，MIC在1～8 mg/L，但对于热带念珠菌在所测试范围内未表现出体外抑菌活性。

空白溶剂对照对所试验的菌株也有一定的体外抑菌活性作用，MIC值一般在125～1 000 mg/L之间。

云南白药含漱剂对所试验的口腔中常见致病菌除了良好的抑菌作用以外，对部分菌株也表现出了杀菌作用，其MBC值大多为MIC的2～4倍，提示云南白药浸膏对这些菌株在MBC浓度下有杀菌作用。

4 讨论

口腔是全身寄居微生物密度最高、种类最多的部位之一，口腔微生物包括细菌、真菌和病毒，其中细菌为最主要的类型，目前能分离到的细菌菌种多达300余种［3］，包括革兰阳性球菌如链球菌属、葡萄球菌和微球菌等;革兰阴性球菌如韦永菌、奈瑟菌属等;革兰阳性杆菌如乳杆菌属、放线菌属等;革兰阴性兼性厌氧杆菌如嗜血菌属、放线杆菌属、嗜碳酸噬纤维菌属，埃氏腐蚀菌等，其他微生物还包括螺旋体属，支原体，真菌，病毒，原虫等。口腔的温度、湿度、酸碱度、氧化还原电势等均是细菌等微生物滋生的良好条件［4－5］。

口腔感染是人体慢性感染中最常见的一种，可表现为牙龈炎、牙周炎、尖周炎、牙髓炎、智齿冠周炎、齿龈脓肿、口炎、唾液腺感染、口腔溃疡、口角炎等［6］。近年来，不断有研究发现口腔细菌与身体其他部位疾病的相关性。如口腔颌面部间隙感染、上下颌骨骨髓炎多为牙源性感染所引起［7］;人口腔内菌斑、唾藏中可培养出与胃内具有相同的形态、生化、免疫特性的幽门螺旋杆菌(Hp)［8］;口腔病灶的患者可引起心内膜炎、心肌炎、心包膜炎、心绞痛、心传导阻滞等［9］，有人统计50%的风湿性心脏病患者同时患有牙周脓肿［10］;有些病灶牙可引起风湿性关节炎;甚至泌尿系统、呼吸系统、消化系统等全身器官或系统的疾病［11］。

对于已有某些基础疾病的患者来说，口腔的清洁情况与其疾病的发展、预后均有密切关系。国外对168名糖尿病患者研究发现，那些患有严重牙龈炎的人很难控制血糖含量［12］。白血病是临床上常见的一种造血系统恶性肿瘤，在疾病发展过程中常伴有发热、脱水等，使口腔唾液浓缩、变稠，口腔黏膜清洁作用丧失，自洁能力下降，细菌迅速繁殖并分解糖类，患者由于白细胞质和量的改变及常伴有免疫功能低下，极易受到感染(据报道化疗期间，口腔感染率在90%以上)，它不但影响患者正常的生理功能，也可导致全身感染，严重者危及生命。由于抗生素的长期使用可能会抑制口腔内正常菌群而导致菌群失调，并进而导致耐药菌株的产生，以及抗生素的毒副作用、易产生耐药性及防治疾病的局限性［13－14］。近年来，中药在口腔感染以及牙周病的防治方面越来越受到重视。

云南白药是我国优秀的传统药物，而现代医学研究正不断发掘着古老药物的药理作用。本试验通过云南白药含漱剂与口腔常见细菌及真菌的体外抗菌活性测定，发现云南白药含漱剂对所试验的需氧菌(MIC值多在2～32 mg/L)、厌氧菌(MIC值多在16～32 mg/L)及部分真菌(白色念珠菌MIC在1～8 mg/L)表现出了较好的体外抗菌活性。云南白药含漱剂对所试验的口腔中常见致病菌除了良好的抑菌作用以外，对部分菌株也表现出了杀菌作用，其MBC值大多为MIC的2－4倍，提示云南白药浸膏对这些菌株在MBC浓度下有杀菌作用。

本次试验发现云南白药含漱剂尤其对口腔的重要致病厌氧菌菌如牙龈卟啉单孢菌(MIC值1～16 mg/L)、伴放线放线杆菌(MIC值0.5～16 mg/L)、具核酸杆菌(MIC值16 mg/L)等有良好的体外抗菌活性。牙龈卟啉单胞菌(Pg)是目前公认的牙周致病菌，Pg是牙周病、尤其是慢性牙周炎病变区或活动部位最主要的优势菌，而健康龈沟内很少［15］。伴放线放线杆菌(Aa)则公认其与牙周炎，特别与侵袭性牙周炎关系密切。具核梭杆菌(Fn)是菌斑、牙周袋等口腔感染部位的优势菌，其检出数量、频率与牙周组织的炎症、破坏程度之间存在着正相关关系［16］。云南白药含漱剂对牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线杆菌、具核梭杆菌等常见牙周病可疑致病菌具有明显的体外抑制作用，提示本受试品可能对牙周病有一定的防治作用，可考虑日常口腔清洁或白血病患者等口腔护理时使用。云南白药含漱剂抑菌作用机制有待进一步研究。

［1］肖刚，吴坚，陈月燕.口腔感染菌的检测分析［J］.现代医药卫生，2006，22(23):3370.

［2］蔡锡麟，许钟英.云南白药的药理研究作用［J］.中成药，1982(8):37.

［3］陈宏，张秀华.中草药抑制口腔常见菌的实验研究进展［J］. 实用医学杂志，2008，24(17):3085－3087.

［4］肖晓蓉.口腔细菌新菌种及分类现状［J］.国外医学口腔医学分册，1998，7(25):207－210.

［5］李艳红，周学东，李继遥.口腔细菌间相互作用研究进展［J］.国外医学口腔医学分册，2002，5(29):148－150.

［6］周学东，岳松龄，谭红.口腔细菌致牙釉质龋的病理学研究［J］. 华西医大学报，1994，25(2):145－148.

［7］倪可夫，来永胜，陈莉丽，等.间隙感染和冠周炎标本中厌氧菌的分离鉴定和体外药效学研究［J］.中国微生物学杂志，1997，9(2):17－19.

［8］陈柯，罗渝宁，任煜光.口腔幽门螺旋杆菌的研究进展［J］.牙体牙髓牙周病学杂志，1999，9(9):249－250.

［9］David B.Drucker，Elizabeth D.Theaker.有关口腔细菌感染最常见的10 个问题［J］. 世界医学杂志，2001，5(8):54－56.

［10］于淼，郝玉庆.慢性口腔感染性疾病与心血管疾病的关系［J］. 国际口腔医学杂志，2008，7(35):396－398.

［11］陈月燕，席云，吴坚.70岁以上老年人群中口腔感染的菌群状况分析(附 73例报告)［J］. 新医学，2007，12(38):809－810.

［12］任静，张艺蔓，夏舟斌，等.云南白药治疗伴糖尿病牙周炎药理学作用的理论基础［J］.昆明医学院学报，2008，(2B):196－200.