HPLC测定莲房不同炮制品中金丝桃苷和槲皮素的含量

王春丽， 张学兰

(山东中医药大学药学院，山东济南250355)

莲房为睡莲科植物莲Nelumbo nucifera Gaertn.的干燥花托。具有化瘀止血的功效。现代莲房的炮制方法主要有煅炭［1］和炒炭［2］两种。研究表明，莲房中富含黄酮类成分［3］，主要有金丝桃苷、腊梅苷、槲皮素［4］等，但炮制对莲房中黄酮类成分含量的影响，尚未见报道。《中国药典》2005版一部仅有莲房的一般鉴别及检查方法，而未收载关于莲房及莲房炭的指标成分和含量测定方法，这对合理评价药材的质量造成了一定难度。本研究以金丝桃苷和槲皮素为指标，建立同时测定两成分的高效液相色谱含量测定方法，并对莲房生品、煅炭品及炒炭品进行比较，为探讨莲房的炮制机理、优选其炮制工艺及控制炮制品的质量提供依据。

1 仪器与试药

Agilent1100高效液相色谱仪(包括DAD二极管阵列检测器，美国Agilent公司);HP色谱工作站(美国Agilent公司);PM PLUS型红外测温仪(美国Raytek公司);JA2003N型电子天平(上海科技仪器公司，精密度为千分之一);FA1604N型电子天平(上海精密科学仪器有限公司，精密度为万分之一);AF240型电子天平(中国瑞士梅勒公司，精密度为十万分之一);多星电炒锅(淄博多星电器集团有限责任公司)。

莲房购自河北祁新中药颗粒饮片有限公司，经本校中药鉴定教研室周凤琴教授鉴定为为睡莲科植物莲Nelumbo nucifera Gaertn.的干燥花托。金丝桃苷、槲皮素对照品(中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号依次为 111521-200303、100081-200406);高效液相用甲醇为色谱纯;娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 样品的制备 生莲房:取原药材，除去杂质及灰屑，切块。

煅莲房炭:按《中国药典》2010年版一部莲房项下方法依法炮制［1］。取净莲房块50 g，230℃密闭煅制3 h，放凉，取出。成品表面焦黑色，内部焦褐色。

炒莲房炭:按《山东省中药炮制规范》2002年版莲房项下方法依法炮制［2］。取净莲房块50 g，用红外测温仪测得锅底温度为280℃时投药，同时计时，以一定频率翻炒至药材表面焦黑色，内部焦褐色，出锅，用时15 min。

2.2 水分含量测定 取各样品粉末(过2号筛)约2 g，按《中国药典》2005年版一部附录Ⅸ H水分测定法(烘干法)测定(n=3)，结果生莲房、煅莲房炭和炒莲房炭的含水量依次为13.14%、6.75%、5.71%。按干燥品计算样品中各指标成分的含量。

2.3 金丝桃苷和槲皮素含量测定［5-6］

2.3.1 供试品溶液的制备 取各样品粉末(过三号筛)约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，称定重量，加热回流1.5 h，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即得。

2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取金丝桃苷标准品12.65 mg和槲皮素对照品15.68 mg，分别置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，制得的金丝桃苷和槲皮素的贮备液分别为0.506 mg/mL和0.627 mg/mL。精密吸取金丝桃苷和槲皮素贮备液各10 mL，置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成质量浓度分别为0.202 mg/mL和0.251 mg/mL的混合对照品溶液。

2.3.3 色谱条件 色谱柱:KromasiL C18(5 μm，4.6 mm×200 mm);流动相A:0.2%磷酸-水，流动相B:甲醇。梯度洗脱:0～15 min，40%B;15～20 min，40% →60%B;20 ～30 min，60%B。柱温:30℃;流速:1 mL/min;检测波长:360 nm。

2.3.4 线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.4、4.8 mL，置 10 mL 量瓶中，加稀释液(流动相A－流动相B配比为60∶40)稀释至刻度，摇匀，各取20 μL进样，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程:金丝桃苷 y=20 325x+30.04，r=0.999 9;槲皮素 y=10 907x－25.78，r=0.999 9;结果表明，金丝桃苷和槲皮素分别在4.04 μg/mL～97.15 μg/mL，5.02 μg/mL ～120.48 μg/mL 范围内具有良好的线性关系。

2.3.5 精密度试验 取生莲房供试品溶液，测定峰面积，结果金丝桃苷的RSD=1.32%，槲皮素的RSD=1.71%，表明仪器精密度良好。

2.3.6 稳定性试验 取生莲房供试品溶液，在室温下自然放置，分别在 0、2、4、6、8、12 h 精密吸取 20 μL进样，测定其峰面积，结果6次测得金丝桃苷和槲皮素的RSD分别为1.63%、1.97%，表明在室温下12 h内供试品溶液稳定性良好。

2.3.7 重复性试验 取生莲房样品约1 g，共6份，精密称定，按2.3.1项下方法制备并测定，结果测得金丝桃苷和槲皮素含量的RSD分别为1.60%、1.90%。表明此方法重复性良好。

2.3.8 样品含量测定 精密吸取供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，分别代入回归方程计算样品中金丝桃苷和槲皮素的含量，色谱图见图1，结果见表1。

图1 混合对照品(A)、莲房生品(B)、莲房煅炭品(C)、莲房炒炭品(D)HPLC图1.金丝桃苷 2.槲皮素Fig.1 HPLC chromatogram of mixed reference substances(A)，Nelumbins Receptaculum(B)，calcined product(C)and carbonized product(D).1.hyperin 2.quercetin

表1 莲房不同炮制品中金丝桃苷和槲皮素含量比较(n=3)Tab.1 Content comparison of hyperin and quercetin in different processed products of Nelumbins Receptaculum(n=3)

2.3.9 加样回收率试验 精密称取已知含量的莲房生品约0.5 g，平行6份，分别精密加入金丝桃苷对照品溶液(0.506 mg/mL)1.5 mL和槲皮素对照品溶液(0.627 mg/mL)0.5 mL，按供试品溶液的制备方法制备并测定，结果金丝桃苷和槲皮素的平均回收率分别为 98.76%、97.24%，RSD分别为1.71%、1.94%。见表2。

表2 加样回收率试验结果Tab.2 Results of average recovery

3 小结和讨论

3.1 本实验采用HPLC法同时测定莲房不同炮制品中金丝桃苷和槲皮素的含量，该方法灵敏度高，所用流动相系统和样品预处理方法简单，快速，可用于莲房饮片的质量控制。

3.2 研究结果表明，莲房经炒炭或煅炭后，金丝桃苷含量下降，而槲皮素含量显著增加。说明加热炮制对莲房中金丝桃苷和槲皮素含量有显著影响。金丝桃苷的熔点为197～199℃，其苷元为槲皮素，槲皮素熔点为315～317℃，槲皮素对热较稳定，莲房制炭后槲皮素含量显著升高，分析可能与金丝桃苷受热后分解生成槲皮素有关。

3.3 对提取溶剂进行了考察，分别采用60%甲醇、80%甲醇、60%乙醇、80%乙醇作溶剂，对样品进行回流提取，结果显示以80%甲醇作为提取溶剂时，金丝桃苷和槲皮素提取率均较高，故选用80%甲醇提取样品。

3.4 曾试验用固定流动相甲醇-0.2%磷酸水的比例(①50:50②45:55③40:60)，对样品中金丝桃苷和槲皮素的含量进行测定，结果显示，① 金丝桃苷出峰时间太短，易与溶剂峰混淆;② 出峰时间适宜，生品分离效果较好，但炭品存在基线漂移、金丝桃苷色谱峰分离度达不到要求的情况;③两种成分分离度较好，基线平稳，但槲皮素出峰时间太长。而用0.2%磷酸水-甲醇梯度洗脱测定样品中金丝桃苷和槲皮素的含量，出峰时间短，峰形较好，且稳定，无其他成分干扰。

3.5 莲房生品化瘀之力偏盛，止血力较弱，多用于胎衣不下，痔疮及产后恶露不绝;制炭后收涩力增强，常用于崩漏，尿血，痔血等下部出血症［7］。现代研究表明，槲皮素具有止血作用，能明显缩短小鼠的出血时间［8］。莲房制炭后止血作用增强分析与槲皮素含量增加有关，莲房中是否还有其他止血成分有待于进一步研究。

［1］中国药典［S］.一部.2010:257.

［2］山东省药品监督管理局.山东省中药炮制规范［M］.济南:山东友谊出版社，2002:234-235.

［3］郭 明，杨群超，朱灵芝，等.荷花不同部位总黄酮分布及荷叶黄酮提取工艺研究［J］.中国现代应用药学杂志，2009，26(3):213.

［4］国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草［M］.上海:上海科学技术出版社，1999:405-406.

［5］中国药典［S］.一部.2005:84.

［6］雍国新.荷叶中槲皮素提取工艺研究［J］.安徽农业科学，2008，36(14):5705-5706.

［7］龚千锋.中药炮制学［M］.北京:中国中医药出版社，2003:129.

［8］Ishida H，Umino T，Tsuji K，et al.Studies on the antihemostatic substances in herbs classified as Hemostatics in traditional Chinese Medicine.I.on the antihemostatic principles in Sophora japonica L.［J］.Chem Pharm Bull，1989，37(6):1616-1618.