荞麦黄酮复方制剂对2型糖尿病大鼠心肌病变的保护作用

高 娜， 韩淑英*， 贾洪娟

(1.华北煤炭医学院药理教研室，河北唐山063000;2.唐山市人民医院河北唐山063000)

2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)的发病率逐年增加，已成为严重威胁人类健康的慢性病，其危害性不仅在于它的发病率高，更主要的是它所导致的慢性并发症范围极为广泛，几乎可以累及全身各组织器官。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病患者最严重的并发症之一，是导致糖尿病心力衰竭和猝死的主要原因［1］，已成为当今医学界研究的热点和难点。目前糖尿病尚无特效药物治疗，西药只是改善症状，中医药治疗在这方面有着极大的优势与潜力。我室前期研究发现:荞麦花叶总黄酮(TFBFL)具有降糖、降脂、软化血管、尤其对压力负荷和去甲肾上腺素所致的心肌肥厚有保护作用［2］。葛根具有降压、降血糖、降低血液黏度等作用［3］。TFBCP是由荞麦花叶总黄酮和葛根等中药提取物按照一定的比例混合而成。本实验旨在研究TFBCP对2型糖尿病大鼠心脏损伤的保护作用，并探讨其可能的机制。

1 材料

1.1 动物 清洁级♂性SD大鼠70只，体质量(200±20)g，由北京维通利华实验动物有限公司提供，合格证号:SCXK(京)－2007－0001，在华北煤炭医学院实验动物中心屏障环境动物实验室喂养和实验。

1.2 药品与试剂

荞麦花叶总黄酮的提取:荞麦花、叶的自然干燥物加去离子水加热回流提取2次(第1次加15倍量水，第2次加10倍量水)，每次1 h，合并2次滤液，浓缩至原液量的1/3～1/4，加分离剂，调pH为5，70～80℃加热搅拌1 h，并趁热过滤，滤液静置沉淀，过滤得黄色沉淀物，经70℃烤干，将干燥物碾成细粉，通过60目筛即为荞麦花叶总黄酮，经中国医学科学院药物研究所鉴定提取物中总黄酮含量可达90% ～95%。

葛根等中药提取物的提取:葛根等中药加水煎煮2次(第1次加15倍量水，第2次加10倍量水)每次煎煮1 h，合并2次滤液，80～90℃水浴上搅拌，浓缩成膏状，放厚玻璃板上，80℃烤箱中干燥，将干燥物碾成细粉，通过60目筛。

TFBCP的制备:由荞麦花叶总黄酮和葛根等中药提取物按照一定的比例混合而成。

大鼠普通饲料和高脂饲料(北京科奥协力饲料有限公司提供)，胰岛素(江苏万邦生化医药股份有限公司，批号:20070105)，链脲佐菌素(美国Sigma公司)，游离脂肪酸试剂盒(南京建成生物工程研究所)，TNF－α放射免疫分析药盒(中国原子能科学院同位素研究所)，消渴丸(广州中一药业有限公司，批号:07100213)。

1.3 仪器 血糖仪(韩国All Medicus公司)，722型分光光度仪(北京市六一仪器厂)，数码照相机(日本佳能公司)，HP－5500彩色超声多谱勒仪(美国百盛公司)，光学显微镜及摄像系统(日本Nikon公司产品)，JEM－100CX 透射电镜(日本)，FT630G型微机多探头放免仪(北京市核仪器厂)。

2 方法

2.1 大鼠2型糖尿病模型的建立 大鼠普通饲料适应喂养一周后，随机取出12只作为正常对照组(Contorl组)，继续给予普通饲料，其余58只给予高脂饲料喂养4周后，用链脲佐菌素(STZ)30 mg/kg(STZ用pH4.3的0.1 mol/L柠檬酸－柠檬酸钠溶液稀释成1%的溶液)腹腔注射，同时正常对照组腹腔注射柠檬酸一柠檬酸钠溶液，一周后以同样方法再注射1次［4］。72 h后，测空腹血糖在10 mmol/L以上者为造模成功。

2.2 分组与给药 将成模2型糖尿病大鼠51只随机分为5组:TFBCP低剂量(L－TFBCP)治疗组13只，按每日0.6 g/kg灌胃给药;TFBCP高剂量(HTFBCP)治疗组13只，按每日1.2 g/kg灌胃给药;消渴丸(XKW)治疗组12只，按每日0.83 g/kg灌胃给药;模型对照组13只，每天灌服相同容积生理盐水，上述各组大鼠每天上午8点灌胃给药，连续8周，同时各组按原饲料继续喂养。

2.3 试验指标测定

2.3.1 血糖、血脂、血清TNF－α的测定 末次给药后禁食12 h，取尾静脉血测FBG(血糖仪法)，比色法测定血清 TG、T－CHO和 FFA，放免法测定血清TNF－α 的水平。

2.3.2 心功能和心重指数(HWI)的测定 末次给药后禁食12 h，称体重，用10%水合氯醛麻醉，将大鼠放置于大鼠固定板上，固定四肢及头部，胸前区以8%硫化钡溶液褪毛，采用HP 5500型彩色超声多普勒仪做超声心动图，探头频率7.5 MHz。将探头置于胸骨左侧，取胸骨旁左心室长轴切面，用M－型超声测量左心室结构和心功能参数(正常组、模型组和 H－TFBCP):LVEDD、LVESD、LVAWT、LVPWT、EF、FS由超声仪自动计算输出。取15个心动周期平均所得数作为测量值，超声心动图由从事超声工作的专业医生进行。然后迅速打开胸腔，腹主动脉取血，取出心脏，置于冰生理盐水中反复冲洗，洗净残留积血，滤纸吸干，用分析天平称取心脏重量，全心重/体重(hw/bw)为心重指数(HWI)。

2.3.3 光镜和电镜下观察心肌组织形态结构改变取左室心尖部心肌组织置入10%中性甲醛溶液固定，梯度酒精脱水、浸蜡、包埋、切片、片厚4 μm，HE染色光镜下观察心肌组织形态学改变。另取左室心肌剪成1 mm3大小，2.5%戊二醛前固定4 h，1%锇酸固定1 h，乙醇逐级脱水，环氧树脂包埋，超薄切片(片厚70 nm)，枸橼酸铅染色，透射电镜观察摄片。

2.3.4 免疫组织化学法测定心肌TNF－α蛋白的表达 载玻片采用多聚赖氨酸(分子量＞3×105)行防脱片处理，采用SABC法进行免疫组织化学染色，按试剂盒说明操作。阴性对照用PBS代替Ⅰ抗。

2.3.5 统计学处理 所有数据用SPSS13.0统计软件进行分析。结果以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 TFBCP对 2型糖尿病大鼠 FBG、TNF－α 和HWI的影响 与正常对照组相比，模型组FBG、血清TNF－α、HWI明显升高(P＜0.01)。各治疗组能一定程度的降低 FBG、血清TNF－α、HWI的水平，尤其荞麦黄酮复方制剂高剂量组作用最显著。见表1。

表1 荞麦黄酮复方制剂对各组大鼠空腹血糖、肿瘤坏死因子-α、心重指数的影响(±s)

表1 荞麦黄酮复方制剂对各组大鼠空腹血糖、肿瘤坏死因子-α、心重指数的影响(±s)

与正常对照组比较，*P＜0.01;与模型对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组别 数量/只 FBG/(mmol/L) TNF－α/(fmol/mL) HWI/(mg/g)12 5.32±2.17 7.21±0.61 3.14±0.17模型对照组 13 17.82±2.42* 9.67±0.48* 4.28±0.20*消渴丸组 12 13.89±3.46 8.85±0.46△ 4.11±0.15 TFBCP低剂量组 13 13.82±3.56△ 8.92±0.62△ 4.06±0.18△TFBCP高剂量组 13 13.25±3.30△△ 8.66±0.51△△ 3.66±0.12正常对照组△△

3.2 TFBCP对T2DM大鼠血脂的影响 模型组大鼠TG、T－CHO、FFA含量明显高于正常对照组(P＜0.01);与模型对照组相比，TFBCP高、低剂量组TG、T－CHO、FFA 含量有不同程度降低(P ＜0.05，P＜0.01)。见表2。

表2 荞麦黄酮复方制剂对各组大鼠甘油三酯、总胆固醇、游离脂肪酸的影响(±s)

表2 荞麦黄酮复方制剂对各组大鼠甘油三酯、总胆固醇、游离脂肪酸的影响(±s)

与正常对照组比较*P＜0.01;与模型对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组别 数量/只 TG/(mmol/L) T－CHO/(mmol/L) FFA/(μmol/L)正常对照组12 0.48±0.11 1.30±0.25 442.7±12.3模型对照组 13 0.73±0.15* 1.83±0.30* 555.4±14.7*消渴丸组 12 0.68±0.13 1.78±0.10 535.1±14.1△TFBCP低剂量组 13 0.62±0.12△ 1.71±0.11△ 536.8±11.1△TFBCP高剂量组 13 0.59±0.15△ 1.59±0.14△△ 533.6±12.4△△

3.3 光镜结果 心肌组织HE染色:光镜下可见正常对照组大鼠心肌组织无形态结构的改变(图1A);模型组大鼠心肌细胞明显肿胀肥大、变性、核明显增大，心肌细胞间成纤维细胞增生，胶原纤维增加，心肌纤维排列紊乱(图1B);TFBCP高剂量组心肌细胞肿胀减轻，病变程度有所改善(图1C)。

图1 心肌组织HE染色光镜结果

3.4 电镜结果 电镜下正常组心肌细胞的各带结构清晰，质膜下吞饮小泡丰富，线粒体结构完好，嵴密集排列，基质密度适中(图2A);模型组大鼠可见到心肌细胞中线粒体数目增多，排列紊乱，挤压，且线粒体肿胀变性，有空泡化，嵴断裂，稀疏(图2B);TFBCP高剂量组大鼠可见肌丝排列趋于正常，明暗带较清晰，线粒体病变减轻(图2C)。

图2 电镜下心肌细胞

3.5 免疫组织化学染色分析 TNF－α染色阳性信号为棕色颗粒，定位于心肌细胞胞浆内。对照组心肌细胞胞浆内可见分布均匀、稀疏的浅棕色颗粒(图3A);模型组心肌细胞内可见浓密的深棕色颗粒(图3B);TFBCP高剂量组的心肌细胞呈散在的棕色颗粒，较模型组明显减少(图3C)。

3.6 TFBCP对T2DM大鼠心功能的影响 超声心动图显示:与对照组相比，糖尿病模型组大鼠心脏左心室结构和功能有明显变化，LVAWT，LVPWT，LVEDD、LVESD增加(P＜0.01)，EF及 FS下降(P＜0.01)，显示心功能降低。TFBCP高剂量组大鼠的心脏功能有明显改善，与模型对照组比较有显著差异(P ＜0.05，P ＜0.01)。(见表3)。

4 讨论

DCM是糖尿病慢性并发症之一，是导致糖尿病晚期死亡的主要原因。延缓DCM的病理进程，对改善预后、降低死亡率有重要的临床意义。研究表明糖尿病代谢异常能导致心肌代谢异常、心肌收缩和舒张功能降低及心肌超微结构的改变。本研究是以高脂高热量饮食加小剂量STZ注射建立的大鼠T2DM模型，结果显示:模型组的血糖、血脂、心重指数较正常组有明显的升高(P＜0.01)，而TFBCP治疗后的大鼠空腹血糖、血脂、心重指数有所降低，光镜和电镜下观察心肌的病理损伤明显减轻，心脏超生心动图结果显示左室舒张和收缩功能均减退，提示已成功地建立了2型DCM模型。

图3 免疫组织化学染色分析

表3 荞麦黄酮复方制剂对2型糖尿病大鼠心功能的影响(±s)

表3 荞麦黄酮复方制剂对2型糖尿病大鼠心功能的影响(±s)

与正常对照组比较，*P＜0.01;与模型对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

LVEDD/mm LVESD/mm LVAWT/mm LVPWT/mm FS EF正常对照组 12 0.51±0.29 0.28±0.03 1.45±0.13 1.38±0.02 5组别 数量2.71±3.05 57.72±3.53模型对照组 13 0.83±0.01b 0.47±0.05b 1.73±0.07b 1.59±0.03b 35.74±5.12b 45.56±4.07b TFBCP高剂量组 13 0.62±0.12c 0.35±0.14c 1.64±0.11 1.51±0.12 47.37±1.13d 50.64±2.35c

研究表明:血脂升高，尤其是游离脂肪酸含量升高可以下调靶细胞膜胰岛素受体数量，并影响其亲和力，干扰胰岛素受体酶联系统的信号传导，抑制糖的氧化和非氧化途径。FFA短期升高能刺激胰岛细胞产生胰岛素，长期作用则促进胰岛细胞凋亡［5］。本实验结果表明:TFBCP高、低剂量组能够不同程度降低2型糖尿病大鼠的血脂含量，因此推测TFBCP可能是降低体内血脂，尤其是通过降低FFA含量，改善FFA所致的胰岛素抵抗，及其对糖的氧化和非氧化途径的抑制，从而达到对2型糖尿病的保护作用。

TNF－α是细胞因子网络中的关键成分，具有多种生物学活性，它具有抗病毒、抗感染、抗肿瘤、免疫调节的作用，但过量的TNF－α作为炎症介质可介导免疫损伤及一些严重的病理生理过程。在大鼠输注TNF－α观察到左室壁变厚、心肌间质纤维胶原减少50%(与对照组比较)。在过度表达TNF－α的转基因小鼠上，发现有细胞凋亡、心脏间质纤维化、心脏间质的浸润细胞数量的增加。提示TNF－α水平增加可能引起心肌细胞空间排列紊乱及细胞外基质改变，从而引起心室重构，左室功能紊乱，最终导致心功能不全［6］。本实验结果表明糖尿病模型组大鼠TNF－α水平明显高于正常对照组，心重指数增加，左心室前壁厚度、后壁厚度轻度增加，左心室舒张末期直径、收缩末期直径明显增加，光镜和电镜下观察心肌的病理损伤，尤其线粒体的损伤严重，证实模型组糖尿病心肌病变的形成。给予TFBCP治疗后，糖尿病大鼠血清TNF－α水平下降，同时心重指数降低，超声心动图显示高剂量TFBCP能明显改善心脏功能，心肌的病理损伤明显减轻，说明TFBCP对糖尿病大鼠心肌的损害具有一定的抑制作用，其机制可能是TFBCP抑制TNF－α的产生而发挥保护心肌作用的。

血糖、血脂、TNF－α三者之间是密切联系，互相影响的。有报道TNF－α通过抑制脂肪合成酶的活性提高脂肪组织和脂肪细胞中的脂肪动员，可显著加强脂肪细胞分泌 FFA［7］。也有人认为 TNF－α通过阻断脂肪细胞内的腺营活性降低Gi蛋白浓度，从而使细胞内cAMP浓度上升，最终导致脂肪分解增多及 FFA水平升高［8］。本研究也表明 TNF－α 与FFA呈高度正相关。另外，FFA抑制葡萄糖氧化，这己被Randle提出的葡萄糖一脂肪酸循环学说己证实;FFA有促进糖异生的作用，并且长期高浓度的FFA也可通过损伤胰岛β细胞功能，使胰岛素分泌减少从而使糖异生增加［9］。

本课题组前期大量研究证明荞麦花叶总黄酮有降糖、降脂、抗炎、抗氧化等作用。葛根具有降压、降血糖、降低血液黏度、改善微循环等作用，荞麦花叶总黄酮和葛根素在体外有抑制非酶糖基化反应的作用。研究显示:葛根对正常小鼠空腹血糖无明显影响，但可明显降低STZ诱导的糖尿病小鼠的血糖和血清胰岛素水平，使胰岛素敏感性指数显著升高［10］。本研究将TFBFL与葛根等中药提取物联合应用于2型糖尿病大鼠，发现其对2型糖尿病大鼠心肌损伤具有保护作用，其机制可能是TFBFL和葛根素等多种成分的共同作用或/和其中的代谢产物发挥多途径、多靶点的综合作用产生的，确切机制有待进一步研究。

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