HPLC检测抗风湿类中成药中非法添加非甾体类化学物质

李存金， 郭飞宇

(1.宜春市药品检验所，江西宜春336000;2.宜春职业技术学院，江西宜春336000)

抗风湿类中成药中非法添加化学物质主要有两类，一类为抗炎、镇痛类西药，有萘普生、芬布芬、保泰松、双氯芬酸钠、吲哚美辛、布洛芬、吡罗西康及氨基比林等。另一类为激素类西药，如醋酸强的松、磷酸地塞米松、强的松等［1］。萘普生、芬布芬、保泰松、双氯芬酸钠、吲哚美辛及布洛芬是非甾体抗炎镇痛药物，抗炎效果显著，解热镇痛效力强，有关各药不良反应报道较多，而且存在用药风险［2］。因此各药的应用需要临床医生的指导。患者服用非法添加了非甾体类化学物质的中成药后，短期内症状缓解，但长远来看会对身体造成伤害。为了有效查处、打击此类假药的生产及销售，参考有关文献［3-7］，研究出HPLC法检测抗风湿类中成药中非法添加非甾体类化学物质萘普生、芬布芬、保泰松、双氯芬酸钠、吲哚美辛及布洛芬的检验方法。

1 仪器与试药

Agilent 1200型高效液相色谱仪(G1314B VWD紫外检测器，Kromasil C18柱 4.6 mm ×250 mm，P/N 07251967，Agilent LC系统化学工作站);Waters 1525型高效液相色谱仪(Waters 2487紫外检测器，Diamonsil C18柱4.6 mm×250 mm，Cat.No 99603，Breeze3.0化学工作站);SK250LHC型超声波清洗器;谱析通用TU1901紫外分光光度计。

萘普生对照品(批号:100198-200403)、芬布芬对照品(批号:100415-200301)、保泰松对照品(批号:100481-200601)、双氯芬酸钠对照品(批号:100334-200302)、吲哚美辛对照品(批号:100258-200403)、布洛芬对照品(批号:100179-200303)。以上对照品均由中国药品生物制品检定所提供;水为二次重蒸馏水;甲醇为色谱纯;其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Kromasil C18柱(4.6 mm×250 mm，P/N 07251967);流动相:甲醇－0.01 mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调pH至3.3)(66∶34);流速:1.0 mL/min;检测波长:263 nm。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取萘普生、芬布芬、保泰松、双氯芬酸钠、吲哚美辛及布洛芬对照品适量，分别加甲醇超声溶解并稀释成浓度分别约为 1.0、1.0、2.5、2.5、2.5、2.0 mg/mL的对照品贮备液，分别精取上述对照品贮备液1、1、1、1、1、5 mL置25 mL量瓶中，加入流动相定容至刻度。摇匀，即得。

2.3 供试品溶液的制备 若供试品为片剂、丸剂、颗粒剂，研细，称取1次最大服用剂量，置具塞锥形瓶中，加25 mL丙酮-乙醇(9∶1)混合溶剂超声处理10 min，滤过，滤液蒸干，用甲醇20 mL分数次溶解残渣并转移至50 mL量瓶中，加入流动相稀释至刻度，摇匀，滤过;若供试品为胶囊剂，取1次最大服用剂量内容物，研细，置具塞锥形瓶中，加25 mL丙酮-乙醇(9∶1)混合溶剂超声提取10 min，滤过，滤液蒸干，用甲醇15 mL分数次溶解残渣并转移至50 mL量瓶中，胶囊壳［8］加热水(70～80℃)10 mL溶解，用氯仿20 mL萃取，萃取液蒸干，残渣加甲醇5 mL溶解，并入上述50 mL量瓶中，加入流动相稀释至刻度，摇匀，滤过;若供试品为口服液［9］，量取5 mL置25 mL量瓶中，加入约15 mL甲醇超声10 min，待温度与室温平衡后，加入乙腈稀释至刻度，超声混匀，置冰箱中冷藏过夜，滤过，取续滤液，即得。

2.4 线性关系的考察 取浓度为 170.40、148.20、1 017.40、423.30、397.50 μg/mL 及 1 033.00 μg/mL 的萘普生、芬布芬、保泰松、双氯芬酸钠、吲哚美辛及布洛芬对照品溶液贮备液 5、6、7、8、9、10 mL 分别置25 mL 量瓶中，分别用流动相稀释至刻度，摇匀。分别精取10 μL注入高效液相色谱仪，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得各组分的线性回归方程:Y=13.934 37X－12.812 54，r=0.999 1;Y=29.803 12X+22.969 18，r=0.999 2;Y=18.415 43X+18.010 35，r=0.999 7;Y=16.229 99X+4.464 31，r=0.999 9;Y=28.727 66X+7.472 41，r=0.999 9;Y=7.456 15×10－1X+2.348 85，r=0.999 7;结果表明，萘普生、芬布芬、保泰松、双氯芬酸钠、吲哚美辛及布洛芬在34.08～68.16 μg/mL、29.64 ～ 59.28 μg/mL、203.48 ～ 406.96 μg/mL、84.66 ～ 169.32 μg/mL、79.50 ～ 159.00 μg/mL、206.60～413.20 μg/mL浓度范围内具有良好的线性关系。

2.5 精密度试验 取对照品溶液重复进样6次，测定峰面积，结果对照品6组份相应峰面积的RSD值均小于0.2%，表明本法精密度良好。

2.6 重复性试验 取同一供试品6份，照2.3项制备供试品，分别测定峰面积，结果平均含量分别为0.40%、0.35%、2.37%、0.98%、0.93%及2.41%，RSD(n=6)分别为0.9%、1.2%、0.4%、1.3%、0.5%及1.7%，表明本法重复性良好。

2.7 稳定性试验 取供试品溶液，照选定方法操作，在0、0.5、1、3、5、24 h 分别进样 10 μL 记录峰面积，6 次测定 6 组份相应峰面积的RSD均小于1.8%。表明本法稳定性良好。

2.8 空白试验 本方法空白试验共测定了5个剂型，20批次抗风湿类中成药样品，取样品，照2.3项制备供试品，按样品测定方法注入液相色谱仪，在对照品溶液成分色谱峰相应的位置上，无其它色谱峰出现，见图1，证明该色谱条件下，各供试品杂质干扰小，各成分峰之间分离度好，6成分峰分离度依次为-、1.88、3.85、14.68、4.00 和 2.33。

图1 HPLC色谱图

2.9 回收率试验 精密称取阴性的样品适量，精密加入萘普生约5 mg、芬布芬约5 mg、保泰松约10 mg、双氯芬酸钠约10 mg、吲哚美辛约10 mg及布洛芬对照品约20 mg。照2.3项制备供试品，按样品测定方法，测定其含量，计算回收率。结果见表1～6。

表1 萘普生回收率结果

表2 芬布芬回收率结果

表3 保泰松回收率结果

2.10 样品的检定结果 取3批自制阳性样品［市场抽得风湿定胶囊、舒筋活血片和小活络丸(用高效液相证明其均不含各待测成分)，以上样品按每克样品各约加4.5 mg萘普生对照品、4.0 mg芬布芬对照品、30.0 mg保泰松对照品、10.0 mg双氯芬酸钠对照品、12.5 mg吲哚美辛对照品、25.0 mg布洛芬对照品，制作阳性样品，研磨均匀，制成3批阳性样品］试验，精密称取的样品适量，照2.3项制备供试品，按样品测定方法试验，见图1，测定其含量。结果见表7～9。

表4 双氯芬酸钠回收率结果

表5 吲哚美辛回收率结果

表6 布洛芬回收率结果

2.11 最低检测限 本实验采用(S/N=3)确定本方法中萘普生、芬布芬、保泰松、双氯芬酸钠、吲哚美辛及布洛芬的最低检测限为 2.1 ng、1.2 ng、2.0 ng、3.4 ng、2.2 ng 及9.3 ng。

3 耐用性试验

3.1 专属性试验 本方法共考察了5个剂型，20批次的抗风湿类中成药样品，在对照品溶液成分色谱峰相应的位置上，均无其它色谱峰出现，证明此方法专属性好。

3.2 流动相比例的选择 流动相甲醇－0.01 mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调pH至3.3)(66∶34)考察了(64∶36)、(66∶34)及(68∶32)3个比例，结果表明在本方法选定的流动相比例微小的变动情况下，杂质成分能很好分离，各待测成分分离度均≥1.88，理论塔板数均≥9 759。因为待测成分较多，经试验发现，流动相中甲醇的比例在66%基础上增大会导致萘普生峰与芬布芬峰的分离度减小，而流动相中甲醇的比例在66%基础上减小会导致吲哚美辛峰和布洛芬峰的分离度减小。因此建议试验时选择甲醇比例为66%，将使6成分同时获得最佳的分离度，且不建议改变流动相的比例。

表7 风湿定胶囊自制阳性样品测定结果

表8 舒筋活血片自制阳性样品测定结果

表9 小活络丸自制阳性样品测定结果

3.3 流动相pH的选择 流动相甲醇－0.01 mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调pH至3.3)考察了0.01 mol/L磷酸二氢钾溶液的pH 3.2、pH 3.3及pH 3.4 3个pH值，结果表明在本方法选定的pH 3.3值微小的变动情况下，杂质成分能很好分离，各待测成分分离度均≥1.89，理论塔板数均≥10 511。故本实验选择流动相pH为3.3。

3.4 色谱柱的选择 我们使用以下不同牌号色谱柱进行试验，均能取得满意的分离效果与理论塔板数。

(1)Kromasil C18柱4.6 mm×250 mm;(2)Diamonsil C18柱4.6 mm ×250 mm;(3)Symmetry C185 μm，4.6 mm ×150 mm;(4)Hypersil ODS 2 5 μm，4.6 mm×250 mm。

4 讨论

取各对照溶液照《中国药典》2005版一部附录IV A紫外-可见分光光度法，进行光谱扫描。取萘普生、芬布芬、保泰松、双氯芬酸钠、吲哚美辛及布洛芬对照品适量加甲醇超声溶解并用流动相稀释成浓度分别约为 30、5、36、20、13 μg/mL及250 μg/mL的待测溶液。以相应的溶剂作为空白对照，照紫外-可见分光光度法测定在200～400 nm范围内扫描。综合考虑萘普生、芬布芬、保泰松、双氯芬酸钠、吲哚美辛及布洛芬的吸收范围，结合中成药和保健品的成分复杂等情况，本方法选择263 nm为分析波长。

［1］吴庆春.中成药非法添加化学药品的类型及鉴别［N］.中国医药报，2005-01-06.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典临床用药须知.化学药与生物制品卷［M］.北京:人民卫生出版社，2005:697.

［3］杜 兴.HPLC法测定风湿松片中保泰松及氨基比林的含量［J］.西北药学杂志，1999，14(2):53.

［4］符 洪，鲁秋红.高效液相色谱法测定龙胆风湿胶囊中吲哚美辛和吡罗昔康的含量［J］.中国药品标准，2002，3(5):300.

［5］中国药典［S］.二部.2005:97，254，644.

［6］王连水，姜建国，张西如，等.液相色谱-质谱联用法检测药品中非法添加的醋酸泼尼松和布洛芬［J］.中国药业，2008，17(14):39-40.

［7］周 瑾，庄惠清.反相高效液相色谱法测定芬布芬片的含量［J］.海峡药学，2007，19(2):37-38.

［8］洪美华，林 达，王楚锦.掺假糖乐胶囊壳的检测［J］.中国药业，2007，16(14):41-42.

［9］国家药品监督管理局.液质联用(HPLC/MS/MS)分析鉴定双氯芬酸的补充检验方法.药品检验补充检验方法和检验项目批准件.批件编号2006006［S］.