重组人骨形态发生蛋白2对壳聚糖-明胶多孔复合支架理化性能的影响

王一腾，白希壮，朱志勇，白茗，张杭州

（中国医科大学 1.附属第一医院骨科；2.92期七年制，沈阳 110001）

重组人骨形态发生蛋白2对壳聚糖-明胶多孔复合支架理化性能的影响

王一腾1，白希壮1，朱志勇1，白茗2，张杭州1

（中国医科大学 1.附属第一医院骨科；2.92期七年制，沈阳 110001）

目的 以组织工程学技术为基础，制备壳聚糖-明胶/骨形态发生蛋白2（BMP-2）多孔复合支架，讨论壳聚糖与明胶的不同配比及向复合材料中加入BMP-2对支架的微观结构和理化性能的影响。方法 分别用不同配比的壳聚糖和明胶制备复合支架，并向1组配比中加入BMP-2。以扫描电镜观察支架的表面特征，测定支架的孔径值、材料的吸水率及表观密度。结果 壳聚糖-明胶多孔复合支架比表面积大，内孔结构多形性高、且大量连通；壳聚糖与明胶配比为4︰1时的复合支架孔径最小，孔壁最厚；配比为1︰4时孔径最大，孔壁最薄；壳聚糖与明胶配比为1︰1时吸水率及表观密度达到最大，分别为（318±75）%和（0.085±0.013）g/cm3；向复合支架中加入BMP-2对支架的微观结构、吸水率及表观密度无明显影响。结论 应用冷冻干燥法可以成功制备壳聚糖-明胶多孔复合支架，支架的微观结构与理化性能与壳聚糖与明胶的配比密切相关，向支架中加入BMP-2对材料的理化性能无明显影响。

壳聚糖；明胶；理化性能；骨形态发生蛋白-2；自体软骨细胞移植

由于理想的自体软骨细胞移植（autologous chondrocyte implantation，ACI）可生成全层的透明软骨［1，2］，近年来开放式 ACI技术不断被用于治疗软骨缺损并取得了良好效果。但由于尚未找到适合关节镜下操作的载体，因此，临床上尚未能应用关节镜完成ACI。

壳聚糖是细胞外基质中糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAGs）结构类似物，具有可生物降解、生物相容性良好、低抗原性、促进伤口愈合、抗菌等特性，它可与带负电的生物大分子，如明胶形成聚电解质配合物［3，4］，壳聚糖还具有较好的力学性能，易于加工成型［5］。明胶是胶原的部分变性衍生物，无抗原性，生物相容性好，可生物降解［6］。壳聚糖具有多种生物活性，而明胶则有利于细胞的贴附，增殖及分化［7］；另外，壳聚糖和明胶均具有促进软骨细胞外基质合成及维持软骨细胞形态与表型的特征，因此，壳聚糖-明胶复合支架被认为在人工皮肤［3，5］、肝组织工程［8］、骨组织工程［9］及软骨组织工程等领域有良好的应用前景。但由于对其在软骨组织工程领域的相关研究有限，壳聚糖-明胶复合支架还未应用于临床治疗关节软骨缺损或成为关节镜下ACI的载体。本研究以组织工程学技术为基础，制备壳聚糖-明胶/骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）多孔复合支架，探讨了壳聚糖与明胶的不同配比及向复合材料中加入BMP-2对支架的微观结构和理化性能的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与材料

壳聚糖（Amresco公司，脱乙酰度>75%）；明胶（Amresco公司）；重组人BMP-2（PeproTech公司）；冰醋酸（分析纯，沈阳化学试剂厂）；去离子水。

1.2 壳聚糖-明胶多孔复合支架的制备

配制0.2mol/L醋酸溶液；将一定质量的壳聚糖溶于0.2mol/L醋酸，配制质量分数为2%的壳聚糖溶液；配制2%明胶溶液；将2%壳聚糖和2%明胶溶液按体积比4︰1，1︰1，1︰4比例混合；并向另一份体积比为4︰1的溶液中加入BMP-22μg。共制备4组混合液；将4组混合液注入直径为8cm的玻璃器皿中，置于-70℃冷冻60min，移入冷冻干燥机内（-50℃，600mT）抽干48h，制成壳聚糖-明胶（BMP-2）多孔复合三维支架材料，烘干备用。

1.3 支架性能测定

1.3.1 扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）观察支架的结构：取直径0.5cm壳聚糖-明胶多孔复合支架，其断裂面经离子溅射仪喷金镀膜后，在扫描电镜下观察其结构；取20个孔计算孔径，并计算平均值。

1.3.2 支架吸水率的测定：切取干燥壳聚糖-明胶多孔复合支架材料并称质量（W0），浸于37℃磷酸缓冲液中30min后取出，用滤纸吸干表面的水分后称质量（W30）。计算吸水率 X（%）=（W30-W0）/W0×100。每份样品重复操作10次，取平均值。

1.3.3 支架表观密度测定：用游标卡尺测定支架材料的直径（D）和厚度（H），用电子天平称量支架材料的质量（W），计算材料的表观密度ρ=W/［π×（D/2）2×H］。每份样品重复操作10次，取平均值。

2 结果

2.1 电镜下壳聚糖-明胶多孔复合支架的结构

表14种复合支架的孔径、吸水率及表观密度Ta b.1Po r e d i a me t e r，r a t e o f w a t e r a b s o r p t i o n，a n d s u r f a c e d e n s i t y o f 4k i n d s o f c h i t o s a n-g e l a t i n s c a f f o l d s Volume ration of chitosan to gelatin BMP-2 Pore diameter（μm） Rate of water absorption（%） Surface density（g/cm3）4︰1 - 81±7 171±21 0.051±0.0074︰1 + 83±7 177±17 0.051±0.0111︰1 - 130±21 318±75 0.085±0.0131︰4 - 173±27 287±40 0.035±0.002

图1A～图1D分别是壳聚糖与明胶配比为4︰1、4︰1（加入 BMP-2）、1︰1、1︰4时复合支架的扫描电镜照片。4种支架的孔径值测定结果见表1。

SEM下4种支架的微观结构对比结果提示：壳聚糖-明胶多孔复合支架比表面积大，内孔结构多形性高、且大量连通；壳聚糖与明胶配比为4︰1时的复合支架孔径最小，孔壁最厚；配比为1︰4时孔径最大，孔壁最薄；向复合支架中加入BMP-2对支架的微观结构无明显影响。

2.2 壳聚糖与明胶的配比及BMP-2对复合支架吸水率的影响

结果如表1所示，壳聚糖与明胶配比为4︰1时材料的吸水率小于1︰4配比时的吸水率；壳聚糖与明胶配比为1︰1时吸水率达到最大［（318±75）%］；向复合支架中加入BMP-2对支架的吸水率无显著影响。

2.3 壳聚糖与明胶的配比及BMP-2对复合支架表观密度的影响

结果如表1所示，壳聚糖与明胶配比为4︰1时材料的表观密度大于1︰4配比时的表观密度；当壳聚糖与明胶配比为1︰1时表观密度达到最大［（0.085±0.013）g/cm3］；向复合支架中加入 BMP-2对支架的表观密度无显著影响。

2.4 壳聚糖与明胶的配比与材料表观密度的关系

壳聚糖与明胶的配比与材料表观密度的关系见图2。在其它情况不变的条件下，我们预测的壳聚糖与明胶的配比与材料表观密度的完整关系见图3。以上曲线将随着实验的进行而不断修正和完善。

3 讨论

壳聚糖-明胶复合支架的微观结构及理化性能受多方面因素影响，如混合液中固体含量、壳聚糖与明胶的配比、预冻温度等。本实验在制备复合支架的过程中，控制其他条件不变，改变壳聚糖与明胶的配比并向其中1组配比中加入BMP-2，以观察其对支架的微观结构及理化性能的影响。

有研究通过X射线衍射证明，在壳聚糖中加入明胶可以增加支架结构的多形性。与单纯的壳聚糖支架相比，细胞在壳聚糖-明胶复合支架上分布及增殖的更加理想。比较在单纯壳聚糖支架及壳聚糖-明胶复合支架上培养的细胞的增殖及存活率发现，壳聚糖-明胶复合支架可改善细胞的效能（cellular efficiency）［10］。比较单纯壳聚糖支架的 SEM照片及本实验复合支架的SEM照片可看出复合支架的内孔形态更加多样，且孔径值变化范围较大。将壳聚糖与明胶复合的优点还在于壳聚糖的结构与特性与糖胺聚糖及其衍生物相似，具有多种生物活性；而明胶则有利于细胞的黏附，增殖及分化。

较多研究认为向壳聚糖中加入明胶及改变壳聚糖与明胶的配比可以改变支架的理化性能，如孔径值、孔隙率、表观密度、机械性能等，但具体影响的趋势还不明确［11，12］。本实验用壳聚糖与明胶的3种配比（4︰1，1︰1，1︰4）配制复合支架，用电镜下的微观结构、表观密度、吸水率来评价不同配比的支架的理化性能。结果显示，壳聚糖与明胶的不同配比是改变复合支架的微观结构和理化性能的变量之一。通过总结数据发现，各项测量数据的变化趋势与配比的改变有较直接的相关性。我们在3组配比的基础上加以合理的预测及进一步的实验便可以掌握某种数据的整个变化趋势。掌握支架材料的理化性能数据的可控性对临床上制作组织工程支架有很大的指导意义。

将生长因子或其他具有生物活性的物质与支架材料复合的意义具有双重性：一方面向支架中加入上述物质可以明显改善在其上培养细胞的分化、增殖、代谢等活动；另一方面，一种降解速率理想的支架材料可以实现生长因子等有生物活性物质的缓慢而有效的释放。生长因子的本质为多肽或蛋白，如BMP-2、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）等生长因子与支架复合而发挥生物活性作用时质量的数量级在μg。因此，我们预测在支架材料中复合生长因子对材料的理化性能不会有明显影响。有研究指出，在壳聚糖-明胶复合支架中加入bFGF对支架的孔径值及孔隙率无明显影响［13］。本实验对比了加入BMP-2前后的壳聚糖与明胶配比为4︰1的两组复合支架的微观结构、吸水率及表观密度，两组支架的各项测量数据无明显差别。在考虑到测量的误差等因素外，认为在复合支架中加入BMP-2对材料的微观结构及理化性能无明显影响。

综上所述，应用冷冻干燥法可以成功制备壳聚糖-明胶多孔复合支架，支架的微观结构与理化性能与壳聚糖与明胶的配比密切相关。向支架中加入BMP-2对材料的理化性能无明显影响。壳聚糖-明胶复合支架在软骨组织工程领域有良好的应用前景。对材料的理化性能的进一步研究以及细胞毒性实验、动物模型实验等研究将使其可能成为关节镜下ACI的理想载体。

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（编辑 王又冬，英文编辑 陈 姜）

Effect of Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein-2on Physicochemical Properties of Porous Chitosan-gelatin Scaffold

WANGYi-teng1，BAIXi-zhuang1，ZHUZhi-yong1，BAIMing2，ZHANGHang-zhou1
（1.Department of Orthopedics，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.The 92th Class，7-year System，Faculty of Clinical Medicine，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the physicochemical properties of porous chitosan-gelatin scaffold prepared with different proportions of chitosan and gelatin and incorporated with bone morphogenetic protein-2（BMP-2）.MethodsChitosan-gelatin scaffolds were prepared with different proporations of chitosan and gelatin，and the volume ratios of these two materials were 4∶1，1∶1，and 1∶4，respectively.BMP-2was added into the scaffold with the volume ratio of chitosan to gelatin of 4∶1.The microstructure and porosity were observed under scanning electron microscope，and the pore diameter，rate of water absorption，and surface density were determined.ResultsFor chitosan-gelatin scaffold，the specific surface area was large，and the endoporus was highly polymorphic and with many interconnections among them.The chitosan-gelatin scaffold with the volume ratio of 4∶1had minimum pore diameter and maximum thickness，and the scaffold with the volume ratio of 1∶4had maximum pore diameter and minimum thickness.The rate of water absorption and surface density reached the maximum values （318%±75%and 0.085±0.013g/cm3）when the volume ratio was 1∶4.No obvious changes in the microstructure，rate of water absorption，and surface density were found after BMP-2was added.ConclusionWe can prepare the porous chitosan-gelatin scaffold with freeze drying method.The physicochemical properties of the scaffold are correlated with the volume ratio of chitosan to gelatin，but not affected by BMP-2.

chitosan；gelatin；physicochemical property；bone morphogenetic protein-2；autologous chondrocyte implantation

R318.08

A

0258-4646（2010）11-0912-03

辽宁省科技计划项目（2007225015）

王一腾（1984-），男，医师，硕士.

白希壮，E-mail：zpmhh@sina.com

2010-05-10