炎症和高渗溶液对莫西沙星透过血-脑脊液屏障影响的研究及疗效评价

郭振勇，赵伟杰，刘 菲(.北京胸科医院，北京 049;.北京市结核病胸部肿瘤研究所药物研究室，北京 049)

血-脑脊液屏障的存在对于保证大脑功能的正常运行至关重要，但是也是治疗许多中枢神经系统感染的瓶颈之一，因为它能阻止大约95%的药物进入脑组织［1］。莫西沙星为第4代氟喹诺酮类抗菌药物，研究证明其体内外抗结核分枝杆菌活性与异烟肼相当［2］，已成为抗耐药结核分枝杆菌治疗方案中重要的组成部分。WHO已将其作为标准的抗MDR-TB(耐多药结核分枝杆菌)的一个组分。文献报道，脑膜在正常情况下，莫西沙星能透过血-脑脊液屏障。而在病理状态下，由于脑膜的破坏，血-脑脊液屏障的屏蔽药物作用有所减弱，进入脑组织的量将会增加［3］，但是由于脑膜破坏的程度各异，增加的量可能也是不同的，所以有必要对进入脑组织的药量进行测定，为临床治疗结核性脑膜炎提供参考。另外，据报道，高渗溶液由于能够使内皮细胞及细胞间紧密连接发生皱缩，因此可以提高血-脑脊液屏障的通透性［4］。所以本文通过动物实验和患者应用甘露醇后脑组织以及脑脊液中莫西沙星浓度的研究，探索莫西沙星进入脑组织的情况，以期为临床治疗结核性脑膜炎提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料:莫西沙星胶囊(拜服乐，400 mg，批号:119209);SPF级BALB/C雄性小鼠(体重18～20 g，首都医科大学试验动物中心);试剂:甲醇、乙腈为色谱纯，氯仿、三乙胺为分析纯。

1.1.2 仪器:Waters-600系列高效液相色谱仪，包括600四元梯度泵、4200紫外检测器、717自动进样器、Empower色谱工作站。

1.1.3 菌株:结核分枝杆菌 H37Rv(ATCC 27294)，由我院药物研究室保存。

1.2 试验方法

1.2.1 小鼠结核性脑膜炎模型的建立及取样:在7H9培养基上生长两周的结核分枝杆菌 H37Rv，经过滤、离心、分散，制成菌浓度为2.5×106cfu·mL-1菌悬液，取21只小鼠经尾静脉注射0.2 mL(菌量为5×105cfu/只)，14 d后形成结脑模型，于第15 d口服给予莫西沙星，剂量为100 mg·kg-1，连续给药5 d，1日 1 次。于第 5 次给药后 0.5、1、2、4、6、10、24 h 取小鼠血样及脑组织，每个时间点3只小鼠。血样经3 000 rpm离心10 min，取血清置-80℃冰箱保存待测。脑组织称重后，置2 mL甲醇中，匀浆，3 000 rpm离心10 min，取上清，置 -80℃冰箱保存待测。健康小鼠连续给药5次，1日1次，于第5次给药后按上述方法取样、处理。

1.2.2 莫西沙星对结核性脑膜炎小鼠模型的治疗作用:取10只SPF级BALB/C雄性小鼠，以上述方法造成结脑模型，分为空白对照组和治疗组。治疗组于第15 d开始给与莫西沙星进行治疗，剂量为100 mg·kg-1，每周给药5次，至8周结束(40个剂量);空白组给予同体积的0.5%CMC。解剖取小鼠脑组织，称重，置于3 mL0.9%氯化钠注射液中，匀浆后，10倍系列稀释接种于7H11培养基中，于37℃ 5%CO2培养箱中培养4周，进行活菌(cfu)计数。

1.2.3 患者血样及脑脊液取样:患者口服400 mg莫西沙星胶囊，连续5 d，并于第5 d服药后2 h抽取血样;4 h穿刺抽取脑脊液。自身对照组按上述方法给药，抽取血样后，静脉给予20%甘露醇250 mL，于30 min内完成;而后于服药后4 h穿刺抽取脑脊液5 mL。

1.2.4 样品处理:取100 μL血样加入800 μL氯仿，涡旋震荡1 min，3 000 rpm离心10 min，取氯仿层37℃氮气吹干，加入200 μL流动相，溶解残渣，进样40 μL。脑组织萃取液及脑脊液经12 000 rpm离心5 min，取上清进样60 μL。

1.2.5 样品测定:色谱条件为流动相∶水乙腈∶三乙胺=82∶18∶0.14，H3PO4调 pH 值至 2.6，λ =295 nm，流速为1 mL·min-1。

2 结果

2.1 健康小鼠及结脑小鼠模型脑组织中的药-时曲线

莫西沙星在健康小鼠和结核性脑炎模型小鼠脑组织中的药-时曲线见图1。可见当有炎症发生时，莫西沙星透过血-脑脊液屏障的量有所增加，给药4 h后，健康小鼠脑组织中莫西沙星的含量已经在最低检测限以下，而给药6 h后，结核性脑膜炎小鼠脑组织中依然可以检测到。按药-时曲线下面积(AUC)计算，AUC健康与AUC结脑相比，增加了21.4%。

图1 莫西沙星在健康和结核性脑膜炎小鼠脑组织中的药-时曲线Fig 1 Concentration-time curves of moxifloxacin in the brain tissue of the healthy mice or in tuberculosis meningitis model mice

2.2 莫西沙星对结核性脑膜炎小鼠模型的治疗作用

莫西沙星治疗8周后，cfu计数结果取对数值为:3.019±0.258;空白对照组为 3.944±0.356。经 t检验，P＜0.05，有显著性差异，表明莫西沙星对结核性脑膜炎有治疗作用。

2.3 甘露醇对患者脑脊液中莫西沙星浓度的影响

患者应用甘露醇后，莫西沙星在脑脊液中的浓度有所增加。因为脑脊液中莫西沙星的含量与血液中药物的含量有关，所以为了具有可比性，我们对试验组和对照组脑脊液中莫西沙星浓度与血液中浓度之比进行比较。甘露醇对莫西沙星透过血-脑脊液屏障的影响结果见图2，甘露醇提高莫西沙星进入脑脊液的量最高达4.2倍。

图2 CSF与血浆中莫西沙星浓度比较Fig 2 Concentrations of moxifloxacin in CSF or plasma

3 讨论

结核性脑膜炎是最严重的肺外结核病之一，其死亡率＞16%，而痊愈者中有＞27%的患者有不同的后遗症。如果是耐药性结核性脑膜炎，其死亡率将会更高。由于莫西沙星的杀菌活性以及能透过血-脑脊液屏障的特性使其有可能成为治疗结核性脑膜炎的有效药物。

文献报道，当脑膜有炎症存在时，炎症能够破坏血-脑脊液屏障的作用，使其通透性有所提高，这对于治疗中枢神经感染是有利的，但是由于脑膜破坏的程度不同以及病程不同阶段脑膜修复的程度不同，药物进入脑组织的量也可能是不同的，有时差别甚至很大［3，5］。所以我们测定了结核性脑膜炎小鼠脑组织中药物的量来研究莫西沙星在脑组织中的药效学。结果表明在炎症情况下，莫西沙星进入脑组织中的量有所提高，其AUC也增加了21.4%，但提高的程度与文献报道相比有差异［3］。这可能是由于小鼠与人的血-脑脊液屏障的组织结构差异或者病变程度不同引起。莫西沙星在脑组织中的药效学研究表明，以降低CFU的作用为指标，它能降低脑组织中的细菌数量。说明即使进入脑组织中的药量低，但仍然能够用来治疗结核分枝杆菌H37Rv引起的结核性脑膜炎。

甘露醇能够提高血-脑脊液屏障的通透性早有报道，它能提高抗肿瘤药进入脑胶质细胞瘤内的量达2～6倍，但是他们采用的是颈动脉给药的方式且用浓度为25%的甘露醇，以期提高甘露醇的高渗作用［4］，这种方法操作复杂，具有危险性，同时会导致血液中一些有毒物质进入大脑，引起意外的损害［6］，所以很少在临床上应用。本研究应用临床常用的降低颅内高压的20%的甘露醇［7］且采用静脉给药方式，只是调整了给与甘露醇的时间，所以不会对患者造成额外的损害。脑膜在正常情况时，莫西沙星在脑脊液中的浓度大约是血液中浓度的50%，有炎症存在时，进入脑脊液的量有所提高;当应用甘露醇后，莫西沙星进入脑脊液的量进一步提高，最多能达到血液中浓度的4倍。这与有研究者认为莫西沙星进入脑脊液可能是一个主动转运过程相符。

我们选定了莫西沙星达峰时(即服药后2 h)给予甘露醇，是因为甘露醇对于血-脑脊液屏障的作用时间较短，作用最强的时间段大约20～30min［8］，所以此时给予甘露醇可以尽量使药物在血中的达峰时间与之相吻合，有利于提高脑组织中药物的含量。文献报道，脑脊液中莫西沙星达峰时间滞后于血液中达峰时间2 h［5］，所以我们在患者服用莫西沙星4 h后抽取患者的脑脊液。

本文由于甘露醇应用于患者的样本量较少，以后将进行大样本的试验，以期具有统计学意义，为将来结核性脑膜炎治疗提供一种新的用药方法。

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