205例先天性非综合征型聋患儿GJB2基因突变分析

陶峥 马衍 欧阳治国 吴皓 李蕴

随着普遍新生儿听力筛查的广泛开展，学者们已开始从基因水平和分子水平对耳聋病因学进行研究，目前已经报道了几种与耳聋有关的缝隙连接蛋白基因突变,其中GJB2基因突变在儿童期发生的常染色体隐性遗传中占有很大比例[1]，而且在不同地域、种族的非综合征型聋人群中，GJB2基因有不同的突变频率和突变类型。

本文对205例上海及周边地区经全面的听力学检查及综合医学评估确诊为先天性非综合征型聋的患儿，分析其GJB2基因的突变频率、突变热点及听力学表型。并对一个确诊为GJB2基因235 delC纯合突变先证者家庭中先证者母亲第2次妊娠时进行产前诊断,并实施早期干预,报告如下。

1 资料与方法

1.1研究对象 205例听力损失患儿均来自上海及周边地区新生儿听力筛查阳性转诊至上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心上海市儿童听力障碍中心就诊者，年龄3个月至4岁,女76例,男129例。

1.2听力诊断方法 所有患儿均通过病史采集、耳鼻咽喉科专科检查、ABR、DPOAE、1 000 Hz探测音声导抗等全面的听力学评估以及CT、MRI影像学检查确诊，详细的听力筛查及确诊程序见文献[2，3]。听力诊断标准: ABR波Ⅴ反应阈≤35 dB nHL[4]且DPOAE通过为听力正常。听力损失程度分级: 以ABR反应阈大于35 dB nHL为异常[4]，结合WHO(1997)的听力障碍分级标准：轻度(36～50 dB nHL)，中度(51～70 dB nHL)，重度(71～90 dB nHL)，极重度(91 dB nHL及以上)。205例中轻度15例，中度25例，重度25例，极重度140例。由遗传学家、神经内科医师等进行综合医学评估，排除综合征型聋。

1.3GJB2基因检测方法 DNA提取采用天根生化科技有限公司血液基因组DNA抽提试剂盒方法(柱纯化法)，GJB2基因PCR扩增采用于飞等[5]报道的方法进行引物设计、PCR扩增及酶切，PCR产物样本送至上海生工生物公司纯化，ABI3730测序仪测序，测序结果使用Genetool Lite 软件包与来自NCBI网站的人类GJB2基因标准序列(ACCESSION:AY280971，VERSION:Y280971.1，GI:33391196)进行比对，同时用Chromas软件检查测序结果峰图。测序结果按照样本编号测序和RFLP分析分别对照比对结果，以防操作失误导致结果错判。

1.4产前诊断方法 在完全知情同意并书面签字的基础上，对1例确诊为GJB2 235delc纯合突变先证者的母亲第2次妊娠孕19周时，通过羊膜腔穿刺术抽取羊水细胞进行DNA提取和基因分析(因为羊膜腔穿刺可能混入母亲细胞，采用羊水细胞培养以换液的方式洗去母亲细胞)，并扩增胎儿羊水细胞以避免错误结果。

1.5统计学方法 用SAS6.12软件采用χ2检验和Fisher精确概率比较，对不同听力损失程度患儿GJB2基因突变情况进行比较。

2 结果

2.1GJB2基因突变检测结果 在205例非综合征型聋患儿中，49例存在GJB2基因突变,占23.90%(49/205)，其中46例患儿存在GJB2基因235delC突变，占93.88%(46/49)。不同听力损失程度患儿GJB2基因突变情况见表1、2。

由表1可见，235delC突变占所有突变等位基因的85.88%[(10+27×2+9)/85]。不同听力损失程度组间比较采用卡方检验，结果χ2=13.804,P=0.003(P<0.01)，差异有统计学意义，说明移码突变听力学表型分布不均。采用Fisher精确概率检验(2-Tail)组间比较，比较不同听力损失程度患儿GJB2基因杂合突变与纯合突变率，结果差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 不同听力损失程度患儿GJB2基因移码突变发生率(例)

注：235delC与其他移码突变复合的9例中5例是235delC/299-300delAT复合突变

表2 不同听力损失程度患儿GJB2基因移码突变等位基因数比较

2.2产前诊断结果 一例胎儿通过羊水细胞产前诊断确诊为GJB2基因235delC纯合突变者，孕妇终止妊娠。

3 讨论

GJB2基因属于缝隙连接蛋白基因,缝隙连接蛋白属于膜蛋白，与相邻细胞的缝隙连接蛋白组成一个完整的缝隙连接通道。Kikuchi等[6]认为缝隙连接在感觉毛细胞受到外界刺激后钾离子回流到内淋巴液的过程中具有重要作用，目前已证实缝隙连接基因家族中GJB2基因突变可引起非综合征型感音神经性聋[7]。携带2个致病移码突变位点(包括各种纯合突变及复合突变)的基因型可以明确是导致耳聋的基因型，由GJB2基因突变所致的耳聋即GJB2基因相关性耳聋。本研究发现上海及周边地区的非综合征型聋患儿中GJB2基因突变的检出率是23.90%，其中最常见的为235delC纯合突变，占GJB2基因相关性耳聋的55.10%(27/49)；其次为235delC单杂合突变占20.40%(10/49)；235delC/299-300delAT复合突变占10.2%(5/49)，说明235delC为上海及周边地区GJB2基因热点突变，与2007年戴朴的报道[8]相似。

本文发现97.95%(48/49)的GJB2基因移码突变非综合征型耳聋患儿听力损失程度为中度以上，说明GJB2基因移码突变可导致较重的听力损失，如果不早期干预可严重影响患儿言语发育。因此，对有二胎生育计划家庭提供遗传咨询、产前诊断、干预以预防聋儿出生，有着极为重要的现实意义。

本组有4.6%(10/205)的患者携带1个致病移码突变位点，没有检测到另1个突变位点的原因可能为其突变位点位于开放阅读框以外的非转录区，或是其它基因突变致病。针对此类患儿家庭，因未能发现2个致病突变位点，所以不能够提供产前诊断服务。

本研究同时发现GJB2基因G79A、A341G和T608C多态。这些多态已被公认为是正常多态;据文献报道,GJB2基因在正常人群中的多态多达10余种,有10余种错义突变属于致病突变，对部分GJB2基因位点突变如G109A的作用人们尚存在争论[9，10]，其到底是致病突变还是非致病多态在我国尚未确立相应的诊断标准，所以GJB2基因诊断遇到错义突变时,必须注意辨别是致病突变还是多态,以免误诊。

本研究为一个GJB2基因235 delC纯合突变先证者的母亲第2次妊娠时进行产前诊断，确诊为GJB2基因235delC纯合突变胎儿,遂终止妊娠，避免了遗传性聋儿的诞生，为家庭、社会减轻了负担。

4 参考文献

1 Estivill X, Fortina P , Surrey S，et al . Connexin26 mutations in sporadic and inherited sensorineural deafness[J]. Lancet, 1998,351:394.

2 吴皓，沈晓明.上海市新生儿听力筛查工作[J].中国医学文摘耳鼻咽喉科学,2007,22:5.

3 吴皓，沈晓明，李蕴，等.大规模新生儿听力筛查与早期干预效果的评估[J].上海交通大学学报(医学版),2007,27:10.

4 姜泗长,顾瑞,主编.临床听力学[M].北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社,1999.387～389.

5 于飞，戴朴，韩东一，等.中国部分地区非综合征型耳聋患者GJB2基因233～235delC突变频率分析[J].中国耳鼻咽喉-头颈外科, 2006,13:223.

6 Kikuchi T. Gap junctions in the rat cochlear immunohistochemical and ultra structuralanalysis[J]. Ana Embryal, 1995, 191:101.

7 Kelsell DP, Dunlop J, Stevens HP, et al. Connexin26 mutationsin hereditary non-syndromic sensorineural deafness[J]. Nature, 1997,387:80.

8 Dai P,Yu F,Han B, et al. The prevalence of the 235delC GJB2 mutation in a Chinese deaf population[J]. Genetics IN Medicine, 2007,9:283.

9 Huculak C, Bruyere H, Nelson TN, et al. V37I connexin 26 allele in patients with sensorineural hearing loss: Evidence of its pathogenicity[J].Am J Med Genet PartA,2006,140(A):2 394.

10 WangYC, Kung CY, Su MC, et al. Mutations of Cx26 gene (GJB2) for prelingual deafnessin Taiwan[J]. Eur J Hum Genet, 2002,10:495.