强化铁营养对缺铁大鼠耳蜗膜性组织actin、myosin、desmin和HSP表达的影响△

周怀恩 孙爱华 岳波,3 王宝东,4 范静平 林顺涨 邓月 杨毓梅

1 第二军医大学长征医院耳鼻咽喉科(上海 200003)； 2 浙江省中西医结合医院； 3 第四军医大学西京医院； 4 济南军区总医院

蛋白质组学(proteomics) 是从整体水平上研究细胞、组织或有机体蛋白质组的一门新兴学科，已成为后基因组时代生命科学研究的核心内容之一。近年来，蛋白质组学技术在内耳疾病研究领域中的应用亦不断取得新进展。Robertson等[1]应用蛋白质组学方法，发现cochlin是大鼠和人耳蜗中最丰富的蛋白质。Ikezono等[2]用双向电泳技术研究发现，牛的人Coch基因同系物具有独特性质，是导致遗传性聋的一个重要原因。此外，蛋白质组和基因组技术已成功应用于毛细胞再生的体外模型研究[3]。

本课题基于前期对强化铁营养影响缺铁大鼠听毛细胞基因表达谱的研究成果，应用Shotgun蛋白质组学技术进一步深入探讨强化铁营养对铁缺乏诱发感音神经性聋大鼠耳蜗膜性组织肌动蛋白(actin)、肌球蛋白(myosin)、结蛋白(desmin)和热休克蛋白(heat shock protein, HSP)表达的影响。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂 Z-800原子吸收光谱仪；S-520型电子显微镜(日本日立公司)；Mini VE Vertical(GE Amersham) ；UMax Powerlook 2110XL(GE Amersham)；SDS-PAGE: Hofer SE 600(GE Amersham)；scanner: Bio-Rad GS710 scanner(Bio-Rad)；LTQ(Thermo Finnigan, San Jose, CA)；冻干机；超滤管；超声机(上海科导超声仪器有限公司SK7200H )；冷冻离心机(BECKMAN COULTERAllegra X-22R Series Centrifuges )；Mettler Toledo AL104天平；色谱柱：C18柱(15cm×150um，CTI，CA)；Trap柱(Zorbax 300SB-C18 peptide traps，Agilent Technologies, Wilmington, DE)；硫酸亚铁(北京化学试剂三厂)；1%戊巴比妥钠(第二军医大学药理教研室提供)。

1.2 实验动物及分组 选用体重25～35 g的健康、无耳疾、ABR阈值正常的1～2周龄Wistar大鼠120只(购于中科院上海动物研究所实验动物中心)，雌雄各半。随机分成实验A组(正常对照组)20只和预实验组(缺铁组)100只，雌雄分养。A组喂以标准饲料16周；按照国际通用的营养性铁缺乏大鼠模型复制方法[4]，以缺铁饲料饲养动物建立缺铁模型，预实验组喂以缺铁饲料8周后，复制出至少有一耳ABR阈值改变≥15 dB的大鼠共41只，再将该41只大鼠随机分成B组(缺铁耳聋组)20只和C组(强化铁治疗组)21只，B组继续喂以缺铁饲料8周，C组喂以强化铁饲料8周。各组动物均自由饮用自来水。

1.3 观察指标及方法 三组所有动物于喂养前、喂养16周后测ABR阈值及DPOAE幅值。测试前用戊巴比妥钠(25 mg/kg)腹腔内注射麻醉，40℃电热毯保温。以Madsen公司产SmartEP Manual Version2.1x型ABR测试系统及Smart OAE Manual Version3.7x型耳声发射测试系统在隔声室内分别测试ABR阈值(波III反应阈)和DPOAE幅值。每次测试前先检查外耳道及鼓膜情况，排除外耳道及中耳疾病。

1.4 大鼠耳蜗膜性成分取材 各组大鼠完成ABR和DPOAE测试后，麻醉下断头处死，解剖出双侧耳蜗，置于DEPC处理的冰冷PBS液(pH=7.45)中，在解剖显微镜下剥离骨性蜗壳，取出膜性成分，包括螺旋韧带、血管纹、基底膜、前庭膜等。以PBS液冲洗血迹，吸干液体后将上述组织一并置于1.5 ml离心管中,置于-40℃冰箱保存，备用。

1.5 蛋白质组学检测 ①蛋白提取：样品化冻后,用生理盐水清洗干净，加入100 μl裂解液[9.5M Urea，4%CHAPS，65mM DTT，2% carrier ampholyte(3-10NL)],罗氏cooktail酶抑制剂，用微量匀浆器将样品匀浆，再超声破碎(80 W，8秒8次，间隔15秒，置于冰上)。整个过程冰浴进行。离心14 000 rpm，1小时，收集上清液。用预冷的丙酮对样品进行沉淀，然后用lysis buffer复溶。②定量：样品用Bradford法定量， -80℃保存。③电泳：定量后的样品各取100 μg，加入上样缓冲液，煮沸5分钟，离心取上清进行上样，SDS-PAGE电泳使用12.5%的胶(15 mA/胶20 min,30 mA/胶，直至溴酚蓝离胶下沿0.5 cm)。④染色: 胶体考马斯亮蓝染色。⑤扫描，获得图谱。⑥进行胶内酶解，最后将酶解液进行质谱检测，最终得到相应的多肽及肽段。

1.6 统计学方法 应用SPSS 13.0统计软件，采用方差分析对蛋白质组学检测数据资料进行处理。

2 结果

2.1 各组动物ABR和DPOAE检测结果 动物处死后证实，A、B和C组动物中各有8耳患中耳炎，可能影响结果分析，数据统计分析时予以剔除。A、B、C三组动物分别取32、32和34耳喂养前及处死前检测ABR反应阈，可见三组动物喂养16周后(处死前)ABR反应阈均高于喂养前，A组与B组比较，ABR反应阈差值差异有统计学意义(P<0.01)，B组与C组比较，ABR反应阈差值差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。

表1 各组动物喂养前及喂养16周后(处死前)ABR反应阈差

三组大鼠DPOAE幅值检测结果见图1、2，实验开始时A、B、C三组之间平均DPOAE幅值曲线基本一致，各频率点无明显差异(P>0.05)； 实验结束时缺铁耳聋组(B组)较正常对照组(A组)平均DPOAE幅值在1.4～6 kHz频率段下降明显(P<0.05)，仅C组较B组在2、3 kHz频率段有改善(P<0.05)(图1、2)。

A—正常对照组，B—缺铁耳聋组，C—强化铁治疗组，Z —本底噪声

A—正常对照组，B—缺铁耳聋组，C—强化铁治疗组，Z —本底噪声

2.2 蛋白质组学检测结果 B组与A组比较：B组大鼠耳蜗膜性组织中的actin、myosin及HSP种类较A组减少，并出现特异蛋白质desmin。C组与B组比较：经强化铁营养治疗后，C组耳蜗膜性组织中的myosin和HSP种类较B组增加，但actin种类未见明显改变，而desmin消失了。质谱检测actin、myosin、HSP结果显示：在A组检测到的alpha cardiac-Actin,aortic smooth muscle-Actin,B、C组两组都消失，质谱检测到B组的第306个为“desmin”蛋白，在A组和C组内没有出现(表2)。

3 讨论

实验研究表明，缺铁诱发耳聋可使大鼠ABR阈值提高，DPOAE幅值下降、引出率降低或消失[5]。本实验中，铁缺乏大鼠ABR阈值提高显著，DPOAE幅值在1.4～6 kHz频率段明显下降，表明缺铁耳聋动物模型复制可靠。由于耳蜗膜性组织中的蛋白质近1 000个，难以对每个蛋白质表达进行差异分析，故实验中仅分析耳蜗膜性组织中actin、myosin、desmin和HSP的差异表达。

actin在耳蜗中主要存在于听毛细胞静纤毛、表皮板及皮板下网状结构，内外柱细胞、Deiter支持细胞及基底膜中甚为少见，不同动物内耳中的分布存在细微差异。目前研究表明，老年性聋、药物性聋、噪声性聋、爆震性聋、缺铁性聋等感音神经性聋与耳蜗内actin变化密切相关，当细胞接受细胞外信号的作用时，actin可发生聚合或解聚，而actin的聚合与解聚直接导致耳蜗螺旋器中actin丝的变化[5～7]。Tilney[6]观察噪声致聋后恢复11天时的蜥蜴耳蜗，发现静纤毛中actin丝原有构象被破坏，静纤毛长毛中近表皮板部actin丝解聚，造成其韧性降低，功能受损，从而产生听觉障碍，提示该区域易受损伤的原因与其中的actin构象变化有关。近年来应用高通量的基因芯片技术发现铁缺乏导致的actin变化在基因转录水平就已经开始，说明肌动蛋白mRNA表达量的减少是actin减少的主要因素之一[7]。本研究结果表明，铁缺乏可导致actin降解或解聚或构象改变，从而损伤听毛细胞、内外柱细胞、Deiter支持细胞及基底膜细胞，同时也说明了缺铁诱发耳聋大鼠耳蜗actin构象的改变是在蛋白质翻译这个层面才开始的。但强化铁营养并未使actin增加，也就是说，单纯的铁剂治疗对于缺铁导致的actin降解或解聚可能没有恢复作用，但是增加铁剂恢复了整体的代谢机制，加强了耳蜗内的解毒机制，使含铁酶等蛋白质代谢状况得到改善，在一定程度上使缺铁诱发的耳聋得到恢复。

肌球蛋白在内耳结构的形成和构建中起着重要作用。如myosinIC是听毛细胞的适应性装置，最近发现[8]myosinIC通过IQ区域与毛细胞上的受体结合并相互作用，这个过程受钙调蛋白的负性调节；myosinⅥ位于富含actin的内耳毛细胞静纤毛根部与表皮板交接处，它的功能是稳定静纤毛基底的连接；myosinⅦA分布遍及整个毛细胞，参与维持静纤毛结构完整性以及内耳毛细胞膜转运过程，并且与静纤毛积聚成束和维持静纤毛的硬度有关[9]。myosin XV分布在哺乳动物耳蜗和前庭毛细胞静纤毛的顶部，它对于形成并维持静纤毛结构，以及静纤毛阶梯状的生长分布起重要作用[10]。myosinⅢ在感觉神经上皮中表达，在内耳中于外毛细胞表达，它主要有运动和蛋白激酶的功能，对细胞骨架的动力学起一定作用[11，12]，其编码基因突变是导致遗传性聋的重要原因[13～17]。本文表2可以看出，myosin在缺铁耳聋组也是减少的， 可能提示铁缺乏对此类细胞的骨架形成都具有抑制作用，或者铁缺乏加速了细胞骨架的降解。

表2 各组耳蜗膜性组织质谱检测到actin、myosin、HSP的种类

而经强化铁营养后，mysion种类和数量明显增加，延缓细胞骨架的降解，从而有助于恢复耳蜗内细胞骨架的完整性。

本研究缺铁耳聋组大鼠耳蜗出现了desmin(结蛋白)表达，而在强化铁治疗后又消失，似与内耳铁代谢调整状态有关，具体机理与意义值得探讨。desmin 于1976年被命名，分子量为52～53 kDa，是骨骼肌、平滑肌和心肌中主要的中间纤维蛋白。desmin连接于z线之间，而使单个肌原纤维连接起来，将收缩运动机械地整合在一起，同时也连接线粒体、细胞核、肌浆网、致密斑、桥粒和其它细胞器。采用同种再重组方法使鼠desmin基因进行无效突变，发现敲除desmin基因鼠生长正常且多产，但是这些鼠又被证明为多系统紊乱[18～21]。结蛋白可以作为成肌纤维母细胞的标志[22]， 结蛋白和alpha平滑肌肌动蛋白在肾小球和间质纤维化中表达增强[23]。因而推测，缺铁诱发耳聋导致耳蜗组织的成肌纤维母细胞生长，活性增强，从而出现了desmin的表达，引起耳蜗出现了纤维化的倾向，从而导致耳蜗损伤引起听功能障碍。强化铁治疗后，减缓或恢复了耳蜗纤维化的倾向，从而有助于听功能的改善或恢复。

本研究另一个重要发现是，HSP在缺铁诱发耳聋和补充强化铁营养过程中的变化非常明显。HSP为机体内一种重要的蛋白质，可显著提高细胞的应激能力，能较强地稳定细胞的内稳态而对抗应激氧化[16，17]。外界环境快速变化，如遇热等，以及细胞快速生长与分化时，如胚胎分化、炎症等HSP表达会明显增加。有作者[18]认为HSP可维持抗氧化酶的活性，增强其清除氧自由基作用。本实验结果提示，大鼠在缺铁诱发耳聋的情况下HSP生成障碍，既造成了氧自由基清除作用的障碍，也影响了细胞内其它蛋白质的合成、利用与运送，使其它蛋白质的含量减少(如肌动蛋白等)，使耳蜗内静纤毛等细胞质膜的稳定作用降低，使细胞的凋亡速度加快、结构改变、功能降低，从而发生耳聋。而强化铁营养可使热休克蛋白种类和数量明显增加，从而减缓耳蜗内细胞凋亡速度，有助于听力恢复。

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