嗜肺军团菌血清1型基因检测及分子分型研究

杨 梦,程慧键,熊长辉,徐晓倩,陈福辉,刘晓青,周海建,袁 辉

嗜肺军团菌血清1型基因检测及分子分型研究

杨 梦1,程慧键1,熊长辉1,徐晓倩1,陈福辉1,刘晓青1,周海建2,袁 辉1

目的 了解南昌市宾馆业中央空调冷却塔水中分离的嗜肺军团菌菌株的基因特征。方法6株分离嗜肺军团菌菌株分别经血清学凝集试验、胶乳凝集试验确定为Lp1型嗜肺军团菌后,利用 PCR技术对军团菌属5SrRNA基因和嗜肺军团菌mip毒力基因的特异序列进行扩增,应用多位点测序(SBT)分析,获得相应的SBT型别。使用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型技术,对菌株进行全染色体DNA酶切电泳分型,并用BioNumerics数据库软件进行分型分析。结果所有的菌株均带有属特异性5S rRNA基因及mip毒力基因,SBT分型6株菌均为ST1型,PFGE聚类分析结果显示菌株带型之间有差异,6株菌可分为4种带型。结论南昌市公共场所冷却塔水中分离的Lp1型嗜肺军团菌菌株基因呈多样性。

嗜肺军团菌;血清1型;分子分型

1 材料与方法

1.1 菌株来源 6株Lp1型嗜肺军团菌均为2006年南昌市6个不同宾馆的中央空调冷却塔水污染状况监测中检得,作为PFGE实验分子量标准对照的沙门菌 H 9812菌株,由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所提供。

1.2 主要试剂 军团菌诊断血清购自上海市疾病预防控制中心,GVPC琼脂、BCYEα琼脂、无半胱氨酸BCYE琼脂、胶乳凝集试剂盒购自英国OXO ID生物公司,PCR扩增反应试剂盒购自上海宝生物工程有限公司,均在有效期内使用。7对管家基因引物由上海生工合成,限制性内切酶 SfiⅠ、XbaⅠ、蛋白酶 K购自大连TA KARA公司。

1.3 主要仪器 PCR扩增仪、脉冲场凝胶电泳仪、凝胶成像仪为美国B IO-RAD公司产品,水浴摇床、二氧化碳培养箱为美国NUA IRE公司产品。

1.4 细菌DNA模板制备 挑取单个菌落于100μL裂解液中混匀,于100 ℃煮沸10 min,冰浴5 min,10 000 r/min离心5 min,取上清液做为 PCR扩增的模板。

1.5 PCR扩增 PCR方法参考文献〔2〕,用5SrRNA和M ip两套引物分别扩增,循环参数为:94℃5min预变性;94 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃60 s,扩增35个循环;最后72℃再延伸5 min。5SrRNA预计扩增片段为130 bp,M ip预计扩增片段为450 bp。产物检测用1%含 GoldView TMDNA染料的琼脂糖凝胶电泳,利用DL 2000 DNA Marker确定产物分子量大小。

1.6 多位点测序(SBT) 使用国际 SBT数据库http://www.ew gli.o rg中公布的引物,对7个基因位点(f la A、pil E、asd、m ip、mom p s、pro A 和 neu A)进行PCR扩增、测序,将得到的序列信息与数据库中的序列进行比对,获得相应的SBT型别编号,见表1。

表1 扩增引物序列Table 1 The sequence of primers used in PCR

1.7 脉冲场凝胶电泳 使用 SfiⅠ作为内切酶。分子量标准株 H 9812用 Xba I酶切,其余参数与受试菌株相同。具体步骤如下:用棉签刮取经培养过夜的适量细菌,均匀悬浊于细菌悬浮液CSB中,使其浓度为5.0个麦氏单位。取400μL细菌悬浊液置于高压灭菌的1.5 m L离心管中,37℃孵育5 m in后,加入20μL蛋白酶 K(20 mg/mL),用400μL溶解完全且已于 56℃水浴 30 m in以上的 1%Seakem Gold胶(内含1%SDS)混匀后,将混合液加入模具,室温下静置15 min,制成胶块。将胶块移入5m L细胞裂解液中,54℃水浴摇床(170 r/min)孵育2 h,50℃水浴摇床中使用同温度纯水清洗2次,每次10 min,同温度 TE buffer清洗4次,每次15 min,清洗后胶块置 TE中备用。用刀片切下2 mm宽的胶块放入1.5 m L离心管中,用50 U的SfiⅠ于50℃酶切4 h。将胶块贴于梳齿包埋于1%Seskem Gold琼脂糖,待胶凝固后,将胶小心放入含2 500 m L 0.5ⅹTBE缓冲液电泳槽中,电泳21.5 h,电泳起始转换时间5.3 s,最后转换时间49.9 s,电压 6 V/cm,电场夹角 120°,电流控制在155 mA左右,温度14℃。电泳结束后,将胶块放入1μg/m L的EB液中染色30 m in,清水脱色1 h后,凝胶成像系统 Gel Doc XR下观察结果。

1.8 聚类分析 采用BioNumerics软件对全染色体DNA酶切图谱进行聚类分析。

2 结 果

2.1 5SrRNA、mip基因PCR检测结果 6株实验菌株军团菌属特异性5SrRNA基因及嗜肺军团菌主要毒力基因mip检测均为阳性(7号菌株为嗜肺军团菌其它血清型),见图1。

图1 5SrRNA,m ip基因PCR检测结果Fig.1 The PCR results of 5SrRNA and m ip

2.2 SBT分型结果 6株Lp1型嗜肺军团菌SBT分型均为ST1型,各基因位点等位基因号见表2。

表2 LP1嗜肺军团菌SBT分型情况Table 2 The sequencing based type result of six Legionella pneumophila serotype 1 strains

2.3 PFGE分型及聚类结果 6株Lp1型嗜肺军团菌经SfiⅠ酶切后进行 PFGE电泳,得到的图谱使用BioNumerics软件处理。按100%的相似性系数进行分型,菌株之间的相似性系数为 72%～100%,6株Lp1型嗜肺军团菌分为4种不同带型,见图2。

图2 6株LP1型嗜肺军团菌PFGE结果聚类图Fig.2 The cluster tree of six Legionella pneumophila serotype 1 strains based on PFGE patterns

3 讨 论

自1976年军团菌被发现以来,已有多起军团菌暴发及散发病例报道。作为新发传染病之一,军团菌病已成为世界各国普遍关注的公共卫生问题。2006年我们对南昌市宾馆业中央空调冷却塔军团菌污染状况进行调查,结果显示,南昌市中央空调冷却塔存在军团菌的污染〔3〕,且其污染率高达53.8%,检出菌型中以Lp1型为主。

PCR方法检测细菌比已往所有传统的外显蛋白质表型检测更为可靠。5SrRNA是军团菌属共有基因,高度保守,其rDNA序列拷贝作为属检测依据是非常可靠的。巨噬细胞感染增强蛋白(mip)是军团菌的主要毒力因子之一,在嗜肺军团菌抵抗宿主细胞内杀灭机制中发挥重要作用〔4〕,m ip基因序列可用作嗜肺军团菌种特异性靶序列来扩增。我们应用PCR技术,对 6株Lp1型嗜肺军团菌进行5SrRNA属基因和m ip型特异性基因检测,均携带嗜肺军团菌属、种基因,从分子角度得以验证。

Lp1型嗜肺军团菌是引起人类肺炎最多见的血清型之一。有报道指出,Lp1型菌株包括至少3个血清亚型〔5-6〕,采用常规的血清学分型方法,对于暴发疫情溯源存在困难,因此采用何种分型方法对于结果分析起着关键作用。目前应用比较广泛的核酸指纹分型技术主要是基于电泳图谱分析的一种分子分型方法,脉冲场凝胶电泳(PFGE)已在国际上广为应用〔7〕。本次研究中的6株Lp1型嗜肺军团菌株分别采自南昌市6所宾馆的中央空调冷却塔水,按100%的相似性系数进行分型,从图2 PFGE聚类图可以看出,菌株间相似性系数存在差异,说明南昌市宾馆业中央空调冷却塔水分离到的Lp1型嗜肺军团菌基因存在多样性。

多位点测序分型(MLST)技术是一种以核苷酸序列分析为基础的分型方法,它是高通量测序技术和成熟的群体遗传学相结合的产物。该方法简单易行,重复性强,能够反映病原菌的群体进化生物学,在流行病学调查和病原菌的分型鉴定中发挥了巨大作用。可利用MLST方法的高分辨率,进行流行菌株间亲缘关系的判定〔8-9〕。但本研究中发现,在Lp1血清型嗜肺军团菌内,菌株7个管家基因的PCR产物序列均无差异,均为ST1型,即未观察到位于同一血清型内部的基因突变,揭示了本地区同一血清型内各菌株管家基因碱基序列的高度保守。

中央空调冷却塔是空调系统中唯一与外界相通的部分,一旦冷却塔水被军团菌污染,极易形成气溶胶,使带有军团菌的气溶胶扩散至空气中造成空气污染,同时对周围环境也存在潜在危害。本研究结果表明,军团菌分子分型方法可以用于不同宾馆军团菌分子流行病学监测及军团菌分子遗传学特征的研究。还可用于研究军团菌优势基因型和优势菌群的分布特征。

(本项研究得到中国疾病预防控制中心传染病预防控制所呼吸道室邵祝军、任红宇、朱兵清等老师的大力支持和帮助,表示感谢!)

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Genetic characteristics of Legionella pneumophila serotype 1 strains

YANG M eng1,CHENG Hui-jian1,XIONG Chang-hui1,XU Xiao-qian1,CHEN Fu-hui1,L IU Xiao-qing1,ZHOU Hai-jian2,YUAN Hui1

(1.Jiang Xi Provincial Center for Disease Control and Prevention,Nanchang 330029;2.National Institute for Communicable Disease Control and Prevention,Chinese Center for Disease Control and Prevention,Beijing 102206,China)

In order to determine the genetic characteristics of Legionella pneumophila serotype 1(Lp1)strains isolated from cooling water within towers of central air conditioning in hotels in Nanchang city,six Lpisolates were identified as Lp1 by serological agglutination test and latex agglutination test.Then PCR was used to detect the special Legionella spp.5SrRNA gene and Lp virulence mip gene.Sequencing based type(SBT)and pulsed-field gel electrophoresis(PFGE)were used in molecular typing.A ll strains were positive with 5SrRNA gene and m ip gene.The SBT typeof all six strainswas ST1.However,the PFGE result showed difference between patterns of six strains,which could be divided into four PFGE patterns.Six Legionella pneumophila isolates from cooling water in towers in public p laces of central air conditioning system s in Nanchang City were genetic diversity.

Legionella pneumophila;serotype 1;molecular typing军团病是由军团菌引起的一种机会获得性呼吸道传染病。军团菌目前大约有50个种,72个血清型。90%以上的军团菌肺炎都是由嗜肺军团菌引起的,嗜肺军团菌血清1型菌株(Lp1)为主要的致病血清型。军团菌的生长和繁殖与环境因素密切相关,尤其在供水系统、空调系统中较为常见〔1〕,主要是通过气溶胶的方式进行传播。本研究采用基因检测、多位点测序、脉冲场凝胶电泳分型技术,对南昌市宾馆业中央空调冷却塔水中分离到的嗜肺军团菌血清1型(Lp1)菌株进行分子特征研究。

R126.4

A

1002-2694(2010)12-1151-03

袁辉,Email:jxcdcyuanhui@126.com

1.江西省疾病预防控制中心,南昌 330029;2.中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,北京

102206

2010-07-11;

2010-09-23