金葡菌对U937细胞XIAP和c IAP1/2表达的影响＊

王佳贺,吴 琼,王 鑫,何 平

金葡菌对U937细胞XIAP和c IAP1/2表达的影响＊

王佳贺1,吴 琼2,王 鑫1,何 平1

目的 探讨X-相关凋亡抑制蛋白(XIAP)和c IAP1/2在金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)诱导的人巨噬细胞系U 937细胞凋亡中的作用。方法采用Western印迹分析检测金葡菌感染不同时间后XIAP和c IAP1/2的表达水平;预先用不同浓度的Embelin(XIAP抑制剂)处理U 937细胞60 min,观察金葡菌感染30 min后U 937细胞的凋亡情况。结果随着感染时间的延长,XIAP和c IAP1/2的表达逐渐下降。加入XIAP的抑制剂Embelin后,U 937细胞的凋亡率随着 Embelin的浓度增加而逐渐升高。结论XIAP和c IAP1/2参与了金葡菌诱导的U937细胞凋亡过程。Embelin通过特异性地抑制XIAP表达增加金葡菌诱导的U937细胞凋亡率。

金葡菌;细胞凋亡;U 937;XIAP;c IAP1/2

金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)在自然界中广泛存在,是临床上常见的主要致病菌之一〔1〕。研究发现,金葡菌可以通过多种机制逃避宿主免疫防御反应并且引起宿主细胞凋亡〔2-4〕。然而,到目前为止,金葡菌引起宿主细胞凋亡的确切机制还不十分清楚。

凋亡蛋白抑制剂(IAPs)家族是近年发现的一类新的细胞内凋亡调控蛋白,至今已发现8个人类IAPs家族成员,其中包括 XIAP和c IAP1/2等,它们在抑制细胞凋亡的过程中起着重要的作用〔5-6〕。其中,XIAP是 caspase的强抑制剂〔7〕。但是,关于金葡菌感染人巨噬细胞系U 937细胞与 XIAP和c IAP1/2是否有关尚未见报道。本研究中,我们探讨了X IAP和c IAP1/2在金葡菌诱导U 937细胞凋亡过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 菌株与细胞株 金葡菌菌株Wood46由中山大学生命科学学院提供,U 937细胞株由中山大学医药生化与分子生物学实验室馈赠,用含10%小牛血清的RPM I 1640培养基传代培养。

1.2 主要试剂 Em belin为Sigma公司产品;Annexin V FITC凋亡试剂盒为 RD公司产品;细胞培养试剂购自Invitrogen公司;其它所有试剂均购自Sigma公司。

1.3 准备细菌 金葡菌菌株Wood46按文献在培养基中培养,离心沉淀细菌,然后用 PBS洗2次。计数金葡菌,用不含抗生素含5%小牛血清的RPM I 1640培养基重悬并稀释。

1.4 细胞培养及加入抑制剂 U 937细胞在10%小牛血清、2mmol/L L-谷氨酸钠、100U/m L青霉素、和100 g/m L链霉素的RPM I 1640培养基中,于37℃5%CO2的培养箱中培养。在此实验中的30 min组,在金葡菌感染前60 min加入不同浓度的Embelin。

1.5 金葡菌感染U937细胞 在细菌感染前,用不含抗生素的RPM I 1640培养基将U 937细胞清洗并重悬,浓度调整至2×106/m L,然后当细胞∶细菌为 1∶20时分别培养 0 min、15 min、30 min、60 min和90 min,离心 2次(3 000 r/min,8 min)洗去未吞噬细菌,置于含20%小牛血清、青霉素及链霉素的RPM I 1640培养基中培养3 h,获得感染的U937细胞。

1.6 Western blot U 937细胞经处理一定时间后,用冷的 PBS洗3次,沉淀物在冰上用裂解液重悬20 min。4℃15 000 g离心30 m in,上清即为总的细胞蛋白溶解成分。用12%的SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳。电泳后,用蛋白转印系统将蛋白转至PVDF膜上(50 m A 60 min)。用5%的脱脂奶粉在1×三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水中封闭1 h。置于兔抗人一抗(用封闭液1∶2 000稀释)中1 h。用含0.1%Tween 20洗涤液洗4次,每次 10 min。然后,将膜与过氧化物酶结合的羊抗兔二抗孵化1 h。用增强型化学发光显色技术显示蛋白条带。为了保证同样数量的蛋白,用丽春红S染色液染色观察蛋白带。用含62.5 mmol/L Tris-HCl(p H 6.7),100 mmol/Lβ-巯基乙醇和2%(V/V)SDS的洗涤缓冲液60℃处理20 min。蛋白带用光密度扫描法进行定量分析。为保证可重复性,每个Western印迹实验用2个单独的膜。在抑制实验中,U 937细胞在加金葡菌处理前,先用Em belin预处理60 min。

1.7 统计学分析 凋亡率用均数±标准差统计,SPSS10.0统计学软件进行统计学处理。多组间均数比较采用单因素方差分析,组间两两比较用最小显著差法。P<0.05具有统计学意义,每组实验重复3次。

2 结 果

2.1 金葡菌对XIAP和c IAP1/2的影响 金葡菌作用不同时间后,免疫印迹法检测XIAP和c IAP1/2的表达。结果显示:随着感染时间的延长,XIAP和c IA P1/2的表达逐渐下降,见图1。

图1 金葡菌感染 U937后XIAP和c IAP/2蛋白的表达Fig.1 The expressions of XIAPand c IAP/2 in S.au reus infected U937 cells＊P<0.05,＊＊P<0.01 compared with that of S.aureus alone

2.2 XIAP在金葡菌诱导的U 937细胞凋亡过程中的作用 用不同浓度的 Embelin预处理U 937细胞,然后用金葡菌诱导U 937细胞凋亡,30 min后收集细胞,用Annexin V FITC/PI双染后流式细胞仪分析U 937细胞的凋亡情况。结果发现,用Embelin阻断XIAP后,细胞凋亡率明显增加,见图2。

图2 不同浓度的 XIAP的抑制剂对 U937细胞凋亡率的影响Fig.2 Effect of different doses of XIAP inhibitor(Embelin)on S.aureus-induced U937 cell apoptosis.＊P<0.05 compared with that of S.aureus alone

3 讨 论

IAPs的特殊分子结构及抑制细胞凋亡的功能正日益受到人们的重视。IAP主要有3个结构域,即B IR、RING、CARD 结构域〔8〕。XIAP 为普遍表达蛋白,是 IAP家族中最具有潜在抑制活性的蛋白,它可以直接结合并抑制caspases并可多途径调节细胞凋亡〔9-10〕。Caspases家族蛋白是调控细胞凋亡发生的关键酶,因此XIAP是功能较强的抑凋亡蛋白之一。XIAP分子中的B IR2结构域亦可以独立地起到完整抑制细胞凋亡的作用。c IAP1/2含有CARD结构域,可直接与肿瘤坏死因子相关因子(TRAFs)-TRAF2结合〔11-12〕。通过 TRAF2 的作用,c IAP1/2被整合到肿瘤坏死因子受体1和2相关的复合体中,调控受体介导的凋亡。

我们过去的研究发现:金葡菌诱导U 937细胞凋亡过程可能与热休克蛋白70(Heat Shock Protein,HSP70) 及核因子-κB(NF-κB)表达的改变有关;Caspase-3/-9参与了金葡菌诱导的U 937凋亡过程并发挥了重要的作用〔13-14〕。在本研究中,我们应用金葡菌感染所致的凋亡U 937细胞作为研究模型,探讨XIAP和c IAP1/2在此过程中的作用。结果显示,随着感染时间的延长,XIAP和c IAP1/2的表达逐渐降低。加入XIAP的抑制剂 Embelin后,U937细胞的凋亡率随着 Embelin浓度增加而逐渐升高。结果表明:XIAP和c IAP1/2在金葡菌诱导的U 937细胞凋亡过程中起到了重要的作用。

金葡菌诱导U 937细胞凋亡的过程包括许多信号转导通路的共同参与,是一个复杂的过程。了解金葡菌诱导U 937细胞凋亡的确切机制对金葡菌感染的治疗将起到非常重要的作用。研究表明,X IAP可以选择性地激活c-Jun氨基末端激酶(JN K1)。XIAP可能位于NF-κB的下游。金葡菌感染U 937细胞后,XIAP和c IAP1/2与其它信号转导通路的关系,尚有待进一步探讨。

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Roles of XIAP1/2 and c IAP in the apoptosis of U937 cell lines induced by Staphylococcus au reus

WANG Jia-he,WU Qiong,WANG Xin,HE Ping

(Department of Geriatrics,Sheng jing H ospita l,China M edica l University,Shenyang 110004,China)

The aim of this study was to investigate the role of X-linked inhibitor of apop tosis protein(XIAP)and c IAP1/2 in the apop tosisof humanmonocytic U 937 cells induced by Staphy lococcus aureus(S.aureus).U 937 cellswere treated with S.aureus at different time points,and Western blo t were performed to detect the expressions of XIAP and c IAP1/2.The U 937 cells were p retreated with Embelin(an inhibitor for XIAP),and the apop tosis ratesof U 937 cells were detected by Annexin V FITC/PIassay.The results showed that the dow nregulation of XIAP and c IAP1/2 by S.aureus were statistically significant and inhibition of XIAPwith Embelin caused further increase in apoptosis of U 937 cells.It is concluded that XIAP and c IAP1/2 participated in the apop tosisof U 937 cells.Embelin increases U 937 cellsapo ptosis induced by S.aureus via inhibiting the expression of XIAP.

S.aureus;apop tosis;U 937;XIAP;c IAP1/2

R378.11

A

1002-2694(2010)12-1126-03

＊辽宁省教育厅科研课题(L2010701)资助

王佳贺,Email:wangjh1@sj-hospital.org

1.中国医科大学附属盛京医院老年病科,沈阳110004;

2.中国医科大学附属盛京医院涉外医疗服务中心,沈阳 110004

2010-07-12;

2010-10-08