猪链球菌四环素耐药性与Tn916接合型转座子的关系＊

白雪梅,赵爱兰,张少敏,王忆婷,孙 晖,叶长芸

猪链球菌四环素耐药性与Tn916接合型转座子的关系＊

白雪梅,赵爱兰,张少敏,王忆婷,孙 晖,叶长芸

目的 研究我国分离的血清2型猪链球菌四环素耐药性与 Tn916接合型转座子的关系。方法采用微量稀释法进行药物敏感性检测,PCR方法检测四环素耐药基因及Tn916接合型转座子。结果我们检测了56株我国分离的血清2型猪链球菌及12株国外分离的血清2型猪链球菌,56株我国分离株均对四环素耐药并且携带四环素耐药基因tet(M),我国猪链球菌携带的tet(M)基因位于接合型转座子 Tn916上。12株国外分离株有7株对四环素耐药,这7株菌携带四环素耐药基因tet(O)并且 Tn916检测为阴性。结论Tn916上的tet(M)基因编码了我国血清2型猪链球菌的四环素耐药性,我国血清2型猪链球菌可能在进化过程中通过水平转移的方式获得了Tn916接合型转座子。

猪链球菌;tet(M)耐药基因;接合型转座子

猪链球菌是一种重要的人兽共患病原菌,2005年我国四川省暴发了猪链球菌引起人类感染的疫情,204人感染,38人死亡。在世界范围内,截至2007年共有409人感染猪链球菌的报道,共73人死亡〔1〕。这一人兽共患病原菌越来越受到关注。我们以前的实验发现我国分离株具有比较普遍的四环素耐药性。有研究表明,转座子Tn916介导了四环素耐药基因的转移。为此,我们通过进一步的检测探讨了猪链球菌四环素耐药性与转座子的关系。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 我国分离的56株猪链球菌包括:1998年江苏病人来源菌株3株,猪来源菌株2株,2005年四川病人来源菌株30株,四川猪来源菌株5株,广东病人来源菌株1株,广西病人来源菌株1株,贵州病人来源菌株1株,江西病人来源菌株1株,江西猪来源菌株1株。2006年四川健康猪来源菌株5株,2007年四川健康猪来源菌株5株。2009年病人来源菌株1株。12株国外来源菌株为加拿大Gao ttschalk教授惠赠。

1.2 药敏实验方法 采用DADE BEHRING公司生产的1型 M ICroSTREP PLusTM链球菌药物敏感性检测板。同时接种质控菌株A TCC49619进行实验条件的质量控制。

1.3 耐药基因检测 目前发现的四环素耐药基因已达30多种,我们检测了革兰氏阳性菌常见的5种四环素耐药基因 tet(K)、tet(L)、tet(M)、tet(O)和tet(Q)〔2〕。

1.4 接合型转座子 Tn916的检测 Tn916是于1981年在粪肠球菌中发现的第1个接合型转座子。粪肠球菌DS16菌株的 Tn916(NC_006372)长度为18kb,携带有四环素耐药基因tet(M),共24个ORF(见图1和表1)。使用PCR方法,在实验菌株中对Tn916转座子编码的24个ORF进行了检测。

图1 转座子Tn916结构图Fig.1 Genetic organization of transposon Tn916

表1 转座子Tn916的检测引物Table 1 Primers for detection of transposon Tn916

1.5 DNA测序 PCR产物纯化后进行直接测序,由TA KARA公司完成。

2 结 果

2.1 药敏结果 我国分离的56株猪链球菌对青霉素、氨苄西林、头孢噻肟、头孢曲松、头孢吡肟、美罗培南、左旋氟沙星、氯霉素、红霉素、阿齐霉素、克林霉素、万古霉素均敏感,对四环素均耐药。加拿大惠赠的12株血清2型猪链球菌中,有7株菌对四环素耐药。

2.2 四环素耐药基因检测结果 使用PCR方法检测了四环素相关的耐药基因5种,发现我国分离的56株菌均携带tet(M)基因。加拿大惠赠的12株血清2型猪链球菌中,有7株菌对四环素耐药,这7株菌则携带四环素耐药基因tet(O)。

2.3 Tn916的检测结果 Int-Tn是转座子 Tn916的整合酶基因,编码转座子整合到新位点所需的整合酶,测定 Int-Tn是目前检测 Tn916常见的方法〔3〕。以 Int-Tn为代表基因检测了我国分离的56株猪链球菌,结果均为阳性。检测的12株加拿大惠赠菌株,结果均为阴性。为进一步确定我国菌株携带Tn916的完整性,使用PCR方法检测了 Tn916转座子编码的24个ORF,发现我国分离的56株菌均携带完整的Tn916转座子。

图2 Tn916转座子基因的检测结果Fig.2 The PCR production of Tn916 1:ORF24;2:ORF23;3:ORF22;4:ORF21;5:ORF20;6:ORF19;7:ORF18;8:ORF17;9:ORF16;10:ORF15;11:ORF14;12:ORF(13,12);13:tet(M);14:ORF(5,6,7,8,9,10);15:Xis-Tn;16:Int-Tn.

2.4 测序结果 以我国猪链球菌分离株SC84为代表,将 PCR产物测序后,得到了 SC84所携带转座子的全序列。GenBank注册号为 EF432727。将SC84菌株携带的 Tn916和已经发表的粪肠球菌DS16携带的 Tn916序列进行比较,发现二者的同源性高达99.3%。在133个差异核苷酸中,有91个位于tet(M),他们的tet(M)序列的同源性为95%。除tet(M)外,其它区段只有42个碱基不同。

3 讨 论

tet(M)是传播最为广泛的四环素耐药基因,已从临床分离的8种革兰氏阴性菌,18种革兰氏阳性菌中检出tet(M)基因〔4〕。加拿大惠赠的12株血清2型猪链球菌,有7株对四环素耐药,编码基因为tet(O)。tet(M)和 tet(O)均编码核糖体保护蛋白,同源性可以达到75%,但tet(M)一般携带于接合型转座子,而 tet(O)一般定位于染色体或质粒〔5〕。tet(O)的传播没有tet(M)那样广泛。

tet(M)位于 Tn916家族接合型转座子上。接合型转座子能通过细胞间的接触从供体菌基因组转移到受体菌基因组。它兼具有转座子、质粒和噬菌体的一些特征〔6〕。Tn916是于1981年在粪肠球菌中发现的。后来又从其它细菌中发现许多接合型转座子 ,如 Tn916S、Tn5386、Tn6009 等〔7-9〕。粪肠球菌DS16菌株的 Tn916(NC_006372)长度为18kb,包括 tet(M)基因在内,共 24个 ORF,ORF23～ORF13为接合性转移基因,位于右末端。除ORF9外,所有基因方向为从右到左。Tn916整合酶基因(int)编码重组酶,附近的切除酶基因(xis)编码类似于lambda Xis的小基础蛋白,目前尚有部分基因功能不明〔10〕。

我们在猪链球菌中检测到了携带 tet(M)等位基因的 Tn916接合型转座子。与粪肠球菌DS16的Tn916(NC_006372)进行全序列比较发现,同源性达到99.3%。共有133个核苷酸的差异点,其中91个位于 tet(M),他们的 tet(M)序列的同源性为95%。除tet(M)外的其它42个差异核苷酸,分布在15个基因上。每个基因分别有1～4个差异核苷酸。在加拿大惠赠菌株中则没有检测出 Tn916的存在。Tn916家族接合型转座子宿主谱广泛,能在多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌间转移,其中常见的是肠道正常菌群和条件致病菌即粪肠球菌。这提示我国分离猪链球菌携带的 tet(M)基因可能是由粪肠球菌水平转移获得的。另外,在我国分离的猪链球菌中检测到了 Tn916转座子的存在,这可能和四环素在养猪行业饲料添加剂中的广泛使用有关。

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Relationship between tetracycline resistance of Streptococcus suis and Tn916-like con jugative transposon

BA IXue-mei,ZHAO Ai-lan,ZHANG Shao-min,WANG Yi-ting,SUN Hui,YE Chang-yun
(State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control,National Institute for Communicable Diseases Control and Prevention,Chinese Center for Diseases Control and Prevention,Beijing 102206,China)

To study the relationship between tetracycline resistance of Streptococcussuis serotype 2 isolated in China and Tn916-like conjugative trans poson,microdilution method was employed for the analysis of antimicrobial sensitivity,and PCR detection of tetracycline resistance genes and Tn916 conjugative transposon was conducted.Tetracycline resistant gene detection was performed for the 56 serotype-2 strains of Streptococcus suis isolated in China and 12 from other countries.It was found that all 56 strains isolated in China was resistant to tetracycline and carried tet(M)gene,and those tet(M)genes carried by China’s Strep to coccus suis were all located on the conjugative transposon Tn916.While the 12 strains from other countries carried tet(O)gene instead of tet(O)gene.It is suggested that S.suisserotype 2 strain might have

the transposon Tn916 conjugative transposon by horizontal transferring during its evolution.

Streptococcus suis;tet(M)resistance gene;conjugative transposon

R378.1

A

1002-2694(2010)12-1085-03

＊科技部国际科技合作与交流专项(20072930)资助

叶长芸,Email:yechangyun@icdc.cn

中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,传染病预防控制国家重点实验室,北京 102206

2010-09-15;

2010-10-15