浙江省猪血清中乙脑病毒的分离鉴定及抗体的测定＊

谢荣辉,朱函坪,张晓锋,徐 芳,杨章女,姚苹苹,朱智勇

浙江省猪血清中乙脑病毒的分离鉴定及抗体的测定＊

谢荣辉1,朱函坪1,张晓锋2,徐 芳1,杨章女1,姚苹苹1,朱智勇1

目的 对浙江嘉兴地区采集的猪血清进行乙型脑炎病毒分离鉴定以及了解该地区猪感染乙型脑炎病毒的状况。方法在浙江省嘉兴地区采集猪血清标本,利用病毒分离方法检测猪血清是否携带乙脑病毒,利用间接免疫荧光法对猪血清进行抗体检测。应用荧光定量RT-PCR方法对新分离病毒进行鉴定;设计特异性引物,利用RT-PCR方法扩增新分离乙脑病毒PrM—E基因,并对新分离病毒进行基因分型和 E基因的分析。结果共采集240份猪血清标本,抗体检测阳性率为61.6%。其中6月中旬50%以上的猪乙脑病毒抗体呈阳性。分离出3株病毒。经荧光定量RT-PCR鉴定3株病毒均为乙脑病毒,基因分析表明3株病毒均属于基因I型乙脑病毒。对这2株乙脑病毒的 E基因区段进行分析,它们之间核苷酸和氨基酸的同源性均为100%。与疫苗株SA 14-14-2相比,核苷酸同源性在87.7%,氨基酸同源在97.0%以上。结论浙江省嘉兴地区猪群中存着乙脑病毒的隐性感染或曾经感染过,提示在该地区自然界中存在着乙脑病毒。

乙脑病毒;E基因;抗体;序列分析

乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV),简称乙脑病毒,是引起流行性乙型脑炎的病原体。乙型脑炎是以三带库蚊为主要传播媒介的人兽共患病,病毒通常在蚊—猪—蚊等动物间循环,其中猪被认为是乙脑最重要的传染源和乙脑病毒传播的主要宿主,在乙脑的流行环节上起重要的作用。因此加强对猪感染乙脑病毒的监测有助于了解乙脑病毒的循环情况,可为预测人群乙脑流行趋势提供依据。本研究于2008年在浙江省嘉兴地区采集猪血清并对其进行病毒分离和抗体检测,以了解目前乙脑病毒在自然界的情况,为预防和控制该病在人群中的流行提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 Taq酶,胶回收试剂盒和X-gal购自 Ta KaRa公司;RNA提取试剂盒购自Qiagen公司,M-MLV逆转录酶和质粒载体p GEM-T试剂盒购自Promega公司。乙脑病毒抗原片由本实验室制备,其他试剂均为分析纯。

1.1.2 细胞和培养液 金黄地鼠肾细胞(BHK-21)细胞由中国疾病预防控制中心病毒所提供,细胞培养采用M EM基础培养基,加10%胎牛血清作生长液,维持液含3%的胎牛血清。

1.1.3 标本来源 2008年5月上旬至8月下旬在浙江省嘉兴市海宁猪舍采集2008年初出生的猪血清标本共240份。

1.1.4 猪血清中乙脑病毒抗体的检测 间接免疫荧光检测猪血清乙脑病毒总抗体。

1.2 方法

1.2.1 标本处理与接种 将100μL猪血清加入到300μL含500U M EM培养基中,4 ℃12 000 r/m in离心15min。取0.3mL上清液接种于BHK-21细胞中,置37℃吸附1h,弃去残余液体,加入维持液,于37℃5%CO2培养箱培养,每日观察细胞病变,连续传3代,无病变者弃去。

1.2.2 Real-time RT-PCR检测乙脑病毒 用 Total RNA提取试剂盒(Qigene公司)按说明书提取新分离病毒感染细胞的总RNA。用 TaKaRa公司One Step RNA PCR Kit进行一步法荧光定量RTPCR检测标本中的乙脑病毒核酸。反应体系:2xOne step RT-PCR buffer III 10μL,上游引物 (20 μmol/L)5′-GGCTCTTA TCACGTTCTTCAAGT TT-3′(239-263)0.2μL,下游引物 (20μmol/L)5′-TGCTT TCCA TCGGCCYAAAA-3′(289-308)0.2μL,探针 (10μmol/L):5′(FAM)-AGCA TTAGCCCCGACCAAGG CG-(TAMRA)-3′(266-287)0.2μL,PrimeScrip tTMRT Enzyme M ix II 0.4μL,Ta KaRa ExTaqTMHS 0.4μL,RNA 模板8.6μL总体积为20μL。充分混匀后。42 ℃逆转录10 min,95℃预变性10s,95℃5 s,57℃30 s,40个循环,由仪器自动设置每个循环57℃退火/延伸步骤读取荧光信号。结果鉴定:在阴、阳性对照均成立时,若病毒在35个循环前有明显的扩增曲线,则该病毒为乙脑病毒。

1.2.3 病毒PrM和E基因区段的PCR扩增及同源性分析 用Total RNA提取试剂盒Rneasy M ini Kit(Qigene公司)按说明书提取感染病毒的第3代细胞的总RNA。根据已发表的乙脑病毒基因序列合 成 引 物 :P1:5′-CGTTCTTCAAGTTTACAGCA TTAGC-3′,P2:5′-TTAAGCA TGCACA TTGGTCG CTAA-3′利用下游引物 P2以病毒基因组RNA为模板进行RT。反应条件如下:全基因使用MLV逆转录酶,参照说明书进行操作。PCR循环参数为94℃预变性 2min,94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸2min,30次循环后,72℃延伸10min,最后置于4℃。PCR产物在琼脂糖上进行电泳后用胶回收试剂盒纯化产物并克隆入 T载体送上海生工测序。用Clustal X和DNAstar进行核苷酸和氨基酸序列分析。

2 结 果

2.1 病毒分离 对240份猪血清处理后接种于BHK-21细胞,结果分离到3株病毒,分别命名为JX61、JX66、JX67。这 3株病毒可在 BHK-21细胞中获得稳定传代,细胞病变主要表现细胞聚集、固缩并逐渐脱落。

2.2 新分离病毒的荧光定量RT-PCR鉴定 对新分离的病毒提取RNA,进行乙脑病毒荧光定量RTPCR鉴定,经过40个循环扩增,通过分析扩增曲线,发现阳性对照呈现S型,Ct值为10.86,阳性对照成立。正常细胞的阴性对照的扩增曲线为平滑直线,故阴性对照成立。3株病毒的扩增曲线均呈S型,Ct值14.26至17.85之间。均小于35,可判定该3株分离毒株为乙脑病毒。

2.3 猪乙脑病毒抗体检测结果 用间接免疫荧光法共检测240份猪血清,有148份阳性,总阳性率为61.6%。5月份猪乙脑抗体水平最低,为21.7%,6、7月渐渐上升分别为63.3%和76.7%,8月最高为91.7%,其中6月份有50%以上的猪血清中乙脑病毒抗体呈阳性。

2.4 新分离病毒的基因分型 采用Chen等建立的基因分型方法对新分离的乙脑病毒进行基因分型鉴定,选择病毒基因组456～695位,属于 PrM区的240个核苷酸序列作为基因分型的基础〔2〕。结果显示,新分离的3株乙脑病毒均属基因 I型。与浙江仙居分离株、上海分离株及四川分离株较为相近,见图1。

2.5 新分离病毒E基因核苷酸及氨基酸分析 采用减毒活疫苗株 SA 14-14-2为标准,对新分离JX61、JX66和JX67的E基因核苷酸及氨基酸进行分析。这3株经荧光定量RT-PCR鉴定为乙脑病毒。3株之间的核苷酸同源性和氨基酸同源性均为100%,与疫苗株的核苷酸同源性87.7%,氨基酸同源性为97.0%。新分离毒株与减毒活疫苗株存在着15个共同的氨基酸差异,分别位于Domain I区的 E-138、E-176和 E-177位,Domain II区的 E-107、E-129、E-222、E-244、E-264 和 E-279 位,Domain III区的 E-315、E327和 E-356位,还有位于这3个活性区外的 E-433、E-439和E447位。新分离的3株乙脑病毒与国内其他基因I型病毒的核苷酸同源性在97.5%～99.3%。氨基酸同源性为98.4%～99.8%。序列比对发现中国各地分离的基因I型乙脑病毒核苷酸及氨基酸的同源性比较高,所有基因I型乙脑病毒之间的核苷酸和氨基酸的差异均不大,但与 II、III、IV之间的核苷酸差异较大,而氨基酸差异并不明显。

图1 PrM基因核苷酸序列系统发生树分析Fig.1 Phylogenetic tree analysis of Pr Mgene nuclectide sequence

3 讨 论

本次调查研究中240份猪血清样本中乙脑IgG抗体阳性148份,阳性率为61.6%(148/240)。表明猪群中存着乙脑病毒的的隐性感染或曾经感染过,猪可能是嘉兴地区乙型脑炎传播的主要环节之一。研究表明:家猪,尤其仔猪是乙脑的主要扩散宿主,猪血清50%乙脑抗体阳转时间出现早或晚直接影响着人间乙脑发病情况,因此,监测猪乙脑病毒感染情况是预测人间乙脑疫情的重要手段之一〔3〕。本研究发现:猪乙脑抗体阳性最早在5月份出现,6、7和8月份抗体阳性率逐渐升高,表明乙脑病毒5～8月份已在该地区自然界中开始传播,这也跟当地80%～90%病例集中在6～8月相符合。且发现猪乙脑血清抗体50%阳转率出现在6月,而分析近年来浙江省乙脑流行情况表明乙脑发病主要集中在7月,占68.5%;次为 8月,占 17.94%。二者综合分析表明猪乙脑抗体50%阳转率3～4w后将出现乙脑发病的高峰期。

本研究从浙江嘉兴地区采集的猪血清标本新分离到3株乙脑病毒都属于基因I型,与浙江仙居、上海、四川、云南、辽宁等地的基因I型乙脑病毒差异不大,表明国内基因I型乙脑病毒具有较高的同源性。

乙脑病毒E蛋白是病毒表面的重要成分,由它形成的表面抗原决定簇,具有血凝活性和中和活性,存在着3个活性结构域,其基因的变异会导致病毒毒力和抗原性的改变〔4-5〕。浙江嘉兴分离到的乙脑病毒E基因与疫苗株SA 14-14-2虽然核苷酸的差异较大,但氨基酸同源性较高。新分离株与疫苗株在E蛋白有15个共同的氨基酸位点差异,其中结构域 I有3个,结构域 II有6个,结构域 III有3个。而结构域 III是乙脑病毒中和抗体结合的重要区域 ,特别是 E337-E34、E377-E382、E397-403 区域发生变异会导致抗原性改变,影响抗原与中和抗体的结合反应,通过对比和分析,新分离株与疫苗株在上述区域完全一致,此外在影响病毒毒力的 E138和影响病毒细胞免疫的 E60-E68位均完全一致,提示新分离株抗原性与疫苗株没有差异,现行的疫苗对新分离株具有预防作用。对中国各地分离的基因I型乙脑病毒核苷酸及氨基酸的同源性比较发现,所有基因I型乙脑病毒之间的核苷酸和氨基酸的差异均不大,但与其他基因型别的乙脑病毒的核苷酸差异较大,而氨基酸差异并不明显。提示目前的疫苗株理论上能诱导机体产生抗体,并对我国目前的基因I型乙脑流行株提供保护。

〔1〕Tsai TF.New initiatives for the control of Japanese encephalitis by vaccination:minutes of a WHO/CV 1 meeting,Bangkok,Thailand,13-15 october 1998〔J〕.Vaccine,2000,26(Suppl 2):1-25.

〔2〕Chen WR,Tesh RB,Rico-Hesse R,et al.Genetic Variation of Japanese encephalitis virus in nature〔J〕.J Gen Virol,1990,71(12):2915-2922.

〔3〕陶三菊.流行性乙型脑炎的流行监测及预防〔J〕.中国计划免疫,2002,8:226-230.

〔4〕Kolaskar AS,Kulkarni-Kale U.Prediction of three-dimensional structure and mapping of conformational epitopes of envelope glycoprotein of Japanese encephalitis virus〔J〕.Virology,1999,261:31-42.

〔5〕Mason PW,Dalrymple JM,Gentry M K,et al.Molecular characterization of a neutralizing domain of Japanese encephalitis virus structural glycoprotein〔J〕.J Gen Virol,1989,70:2037-2049.

〔6〕Wu SC,Lin CW.Neutralizing pep tide ligands selected from phage displyed libraries mimic the conformational epitope on domain III of the Japanese encephalitis virus envelope protein〔J〕.Virus Res,2001,76(1):69.

Isolation of Japanese encephalitis virusand detection of an tibody against Japanese encephalitis virus in serum of swine from Zhejiang

X IE Rong-hui,ZHU Han-ping,ZHANG Xiao-feng,XU Fang,YANG Zhang-nv,YAO Ping-ping,ZHU Zhi-yong

(Zhejiang Provincial Center for Disease Control and Prevention,Hangzhou 310009,China)

In order to study Japanese encephalitis virus carried by swine and investigate serum from Jixin region in Zhejinag p rovince antibodies against JEV were tested by IFA.Japanese encephalitis virus in sera were detected by virus isolation.The isolated strains were identified by real time RT-PCR.The Prm-E gene of the isolated viruswasamplified by RT-PCR.The result showed that antibodies against JEV were found in 148 out of 240 serum samples and the total positive rate was 61.6%.Three strains were isolated with cytopathogenic effect(CPE)in BHK-21.The phylogenetic analysis showed that the new isolates belonged to genotype I of JEV.Sequence analysis showed that the homology of nucleo tide sequences and amino acid sequences among three strains were 100%.Compared with the nucleotide sequences between two strains and the JEV vaccine strain SA 14-14-2,the homology was up to 87.7%,and homology of amino acid sequences were up to 97.0%.Compared with the vaccine strain,there were 15 common amino acid sequences in all the three strains.

Japanese encephalitis virus;E gene;antibody;sequence analysis

R373

A

1002-2694(2010)12-1123-03

＊浙江省医药卫生科学研究基金资助项目(2008B39)

谢荣辉,Email:ghost_rhxie@hotmail.com

1.浙江省疾病预防控制中心,杭州 310051;2.浙江省农业科学院,杭州 31002

2010-05-20;

2010-09-03