真武壮肾汤对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化防治的实验研究

刘　莎　张　丹　张义兵

[摘要] 目的:探讨中药真武壮肾汤对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化防治的效果及机制。方法:将36只大鼠随机分为:假手术组、模型组、中药组,采用单侧输尿管梗阻(UUO)制作动物模型,术后7、14 d检测肾组织TGFβ1及FN的表达。结果:中药组较模型组大鼠肾组织TGFβ1表达减弱,而FN生成减少。结论:真武壮肾汤可抑制TGFβ1表达,对抗肾间质纤维化。

[关键词] 肾间质纤维化;真武壮肾汤汤;TGFβ1;FN

[中图分类号] R692

[文献标识码] A

[文章编号] 1674-4721(2009)08(a)-048-02

肾间质纤维化是多种肾脏疾病走向慢性肾衰竭(CRF)的共同病理过程,发病机制迄今尚不确切。本研究采用单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)大鼠模型进行实验研究,以探讨真武壮肾汤防治肾间质纤维化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

SD雌性大鼠36只,清洁级,体重180～200 g,适应性饲养1周,随机分为假手术组、模型组、中药组,每组均为12只,实验期间动物自由饮水、摄食。

1.2 药物及试剂

真武壮肾汤(主要由熟附子、茯苓、白芍、白术、莪术、三七、生大黄等中药组成)水煎,分别浓缩成每毫升相当于生药1.0 g(自制),4 ℃冰箱保存备用。

免疫组化超敏SP试剂盒由北京中山公司提供,其余抗体均由武汉博士德生物工程有限公司提供。

2 实验方法

2.1 实验动物干预处理

参照文献以2.5%戊巴比妥(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后,于左侧腹部切开皮肤,游离左侧输尿管,分别在肾盂处和输尿管上1/3处用丝线结扎后,不切断输尿管,逐层缝合皮肤,假手术组仅游离大鼠左侧输尿管,不进行结扎。造模前1天开始灌药,中药组大鼠分别每日按10.0 g/kg体重灌胃,连续3周。假手术组及模型组均给等量生理盐水灌胃处理。实验过程均无死亡大鼠,分别于术后第7、14天各处死6只。

2.2 一般及病理观察

大鼠处死后,迅速取出左侧肾脏,肾组织经4%甲醛浸泡固定,脱水,石蜡包埋,制成约3 μm厚切片,做苏木素-伊红染色(HE)。

2.3 免疫组化

用SP法检测实验大鼠肾间质TGFβ1及FN的表达,严格按SP试剂盒说明进行免疫组化技术操作。

2.4 计算机图像系统分析

随机选取5个不含肾小球和血管的不重叠视野(×400),以肾间质棕褐色染色区为阳性目标区,用彩色多媒体病理图像分析系统进行灰度变换后,计算阳性区域占该视野面积百分率,以5个视野的平均值表示纤维化病变程度。

2.5 统计学处理

所有数据用(x±s)表示,采用SSPS 13.0统计软件进行分析,采用单因素χ2比较。

3 结果

3.1 一般及病理观察结果

假手术组大鼠左肾未见病理改变,模型组及中药组第7天出现肾间质增宽,炎性细胞局灶或弥漫性浸润。模型组第14天肾间质炎性细胞弥漫浸润,小管上皮细胞变性、坏死,肾间质明显增宽,皮质和外髓萎缩小管较多,纤维化明显;中药组同期相比肾间质增宽程度减轻,炎性细胞浸润减少,间质病变程度明显减轻。

3.2 各组大鼠FN表达

与假手术组比较UUO后肾皮质中胶原蛋白的含量明显升高,见表1,图1。

3.3 各组肾间质TGFβ1表达

假手术组大鼠肾组织中仅见肾小球系膜细胞和小管上皮细胞表达较弱的TGFβ1,在模型组及中药组大鼠TGFβ1广泛表达于肾小管上皮细胞胞浆中,而且在纤维化的肾间质中亦有较强表达,尤其模型组表达最强(P<0.05)。见表2,图2。

4 讨论

祖国医学并无本病名,据其发展过程中的临床表现及发病特点,我们认为其属于“水肿”、“癃闭”、“关格”、“肾劳”、“虚劳”、“溺毒”、“尿血”等范畴[1]。本方由真武汤加减而成,真武汤出自《伤寒论》,由附子、茯苓、芍药、白术、生姜组成,具有温阳利水、温经散寒之功效,主治脾肾阳虚、水湿内停之证。炮附子大辛大热,使肾阳得复、气化得行;白术,甘苦而温,燥湿健脾,颇合“脾喜燥恶湿”之性,附子振肾阳于先,姜、术复脾阳于后。茯苓助姜、术之健脾强运,可淡渗水湿,使阴邪从小便而行。生姜辛而微温,走而不守,宣肺温胃,助附子行散溢于肌表之湿。芍药敛阴护液,敛阴缓急,一则防姜、术、附等温燥之品伤阴之弊。一则《本经》载芍药“能利小便”。加莪术、三七活血化瘀,生大黄泄浊,诸药配伍,温脾肾,利水湿,共奏温阳利水之效。有报道[2]大黄及其提取物可有效降低肾小管上皮细胞的增殖,降低其细胞代谢,从而减轻高代谢状态对健存肾单位的损害。

肾间质纤维化是多种原因引起的细胞外基质(ECM)成分在肾间质内过度沉积,积聚在肾间质的ECM成分复杂,FN是ECM成分之一,肾间质纤维化时ECM在肾间质内沉积,在一些因素的刺激下,成纤维细胞被活化并发生功能和表形转化,转变为表达肾小管间质骨架蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的肌成纤维细胞(MFB),后者具有更强的合成ECM的能力,MFB首先分泌FN,为其他ECM成分的沉积和胶原纤维的形成提供支架[3]。

肾间质纤维化的发生涉及多种细胞和细胞因子构成的网络系统,TGF-β是目前发现最强的促肾间质纤维化分子,潜伏的TGF-β可由肾脏固有细胞或浸润白细胞产生,大多数细胞表面都有TGF-β的受体[4]。于俊生等[5]将60只大鼠随机分为正常对照组、正常灌胃组、造模组及造模灌胃组,运用单侧输尿管结扎法(UUO)制造肾间质纤维化模型,术后5周取术侧肾脏组织做染色,并应用免疫组化检测各组大鼠TGFβ1的表达,结果显示肾间质纤维化后致纤维化因子TGFβ1表达上调,经和络泄浊方灌胃后,肾间质TGFβ1表达下调,纤维化程度较造模组显著改善。Hwang M等[6]的研究表明当采用干扰 RNA技术抑制TGFβ1表达后,肾间质纤维化程度显著减轻。TGFβ1在肾间质纤维化病理过程中的主要作用有刺激细胞分泌 ECM,抑制 ECM的降解,促进炎性细胞浸润,刺激肾小管上皮细胞转分化。

本实验发现,模型组大鼠肾间质可见ECM大量沉积,TGFβ1表达显著增加,出现肾间质纤维化,中药组则肾间质沉积的ECM明显减少,且与TGFβ1表达变化相一致(P<0.05),肾病理组织检查也有所改善。

综上所述,我们认为真武壮肾汤可抑制TGFβ1表达,抑制FN等ECM的过度沉积,从而减轻肾小管间质的病理性损伤,抑制肾间质纤维化的产生,但其具体抗纤维化作用机制还有待进一步探讨。

[参考文献]

[1]晏子友,皮特衡,高书亮,等.化瘀解毒汤对转化生长因子β1及血管紧张素Ⅱ作用的研究[J].江西中医学院学报,2002,14(2):13.

[2]陈美芳.抗肾间质纤维化在肾脏病研究中的新进展[J].辽宁中医药大学学报,2008,10(6):49-50.

[3]李才.器官纤维化基础与临床[M].北京:人民卫生出版社,2006:97.

[4]Mezzano SA,Droguett MA,Burgos ME.Overexpression of chemokines,fibrogenic cytokines and myofibroblasts in human membranous nephropat hy[J].Kidney Int,2000,57(1):147-158.

[5]于俊生,刘海军.和络泄浊方对肾间质纤维化大鼠转化生长因子TGF-β1表达的影响[J].中医药学刊,2006,7(24):1220-1221.

[6]Hwang M,Kim HJ,Noh HJ,et al.TGF-beta1 siRNA suppresses the tubuloi-nterstitial fibrosis in the kidney of ureteral obstruction[J].ExpMol Pathol,2006,81(8):48-54.