枯草芽孢杆菌抑菌作用的实验研究

范永瑞

【摘要】 枯草芽孢杆菌抗均蛋白对很多病菌都有抑制或杀灭作用，实验中对大肠杆菌的拮抗作用进行了研究。结果表明，枯草芽孢杆菌大肠杆菌拮抗作用较为明显。

【关键词】 枯草芽孢杆菌；大肠杆菌；紫外线诱变

芽孢杆菌在自然界分布非常广泛，多数芽孢杆菌的抗菌物质具有抗菌谱广，对酸碱度要求不高，热稳定性好，易于进行分子加工等特点，这些都为开发新型天然防腐剂以及生物防治剂提供了很好的条件。枯草芽孢杆菌可由稻草中分离得到，对许多植物病原生物具有拮抗作用的非病原微生物。研究枯草芽孢杆菌对大肠杆菌的拮抗作用，并通过紫外诱变手段筛选出高抗大肠杆菌的菌株。

一、材料与方法

1、供试菌种

实验菌种 ：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌

2、培养基

液体种子培养基：为牛肉膏蛋白冻培养基（不加琼脂粉）。

固体种子培养基：在液体种子培养基基础上加入18g/L的琼脂粉。

3、枯草芽孢杆菌的制备

取稻草约500g，浸泡在清水中2h，再将其煮沸30min，后37℃下培养。24h后再将其煮沸30min，吸取液体1ml于9ml无菌水中，摇匀制成菌悬液，将菌悬液滴两滴在固体种子培养基上，涂布均匀，37℃下培养48h。最后挑单菌落于液体种子培养基中，37℃下培养48h。

4、枯草芽孢杆菌的紫外诱变

取培养至对数生长期的枯草芽孢杆菌菌液离心（10000r/min，20min），取沉淀收集细胞，用无菌生理盐水洗涤2次。玻璃珠振荡15min。分别取10ml菌悬液于5个直径9cm的无菌培养皿中，摇匀。无菌条件下在30W，60CM的紫外灯下打开培养皿盖分别照射60s，90s，120s，150s，180s。不同诱变时间处理的菌悬液各取1ml加入液体种子培养基中37℃黑暗下培养24h。同时取1ml未诱变的菌悬液培养作为对照。致死率=（对照组菌数-此诱变时间下菌数）÷对照组菌数×100%

5、诱变菌株的筛选

培养24h的枯草芽孢杆菌吸取1ml于装有9ml无菌水的试管中，摇匀；再从中吸取1ml菌悬液，重复上个步骤，直至稀释到10-4。用异步培养法挑选高产单菌落。即将稀释到10-5的菌悬液涂布平板，然后将其倒扣于装有一薄层氯仿的培养皿盖熏蒸50min，让菌落固定在固体种子培养基表面。移去培养皿盖，让平板中的氯仿挥发40min。再取0.5ml 107-108cfu/ml的大肠杆菌菌悬液涂布在此平板上。待平板晾干后37℃培养72h。取所有平板中抑菌圈最大的单菌落扩大培养。

二、结果与分析

1、不同培养时间对抑菌效果的影响

图1 抑菌圈随培养时间的变化

枯草芽孢杆菌随着培养时间的增加，他的抑菌效果总的来说呈上升趋势，但其中有抑菌圈变小的过程，这不是说明抗菌蛋白的效果降低了，而可能是由抗菌蛋白的产生时间于大肠杆菌的扩增时间的差别造成的。抗菌蛋白是要到枯草芽孢杆菌的平稳期时才会产生，在这之前是由于接种液中含有抗菌蛋白，它在抑制大肠杆菌的生长。当它逐渐消耗而枯草芽孢杆菌处于非平稳期，没有新的抗菌蛋白产生时，大肠杆菌处于快速增殖的过程，大肠杆菌就会逐渐蔓延，掩盖部分抑菌圈，就表现为抑菌圈的减小。当枯草芽孢杆菌达到平稳期后，抗菌蛋白大量产生，使大肠杆菌死亡，抑菌圈就逐渐扩大。

2、不同接种量芽孢杆菌对大肠杆菌的抑制效果

图2 不同接种量对抑菌效果的影响

经过不同剂量的枯草芽孢杆菌抑制大肠杆菌，经测量发现抑菌圈先随剂量的增加而增加，200μl的时候达到最大；后就逐渐变小。其原因是剂量越多，它含的枯草芽孢杆菌就越多，产生的抗菌蛋白越多，所以抑菌效果越好；但达到一定数量后，在有限的营养中枯草芽孢杆菌之间会产生竞争关系，反而会抑制菌群的生长，降低了抗菌蛋白的产生量。

3、不同紫外诱变不同时间的结果

在30W，60CM处诱变不同时间，60s时致死率最低，但其正突变率太小。随时间的增加，致死率越来越大，180s时菌种几乎全被杀死。90s，120s，150s三个时段的致死率相差不大，而且在可接受范围内。但150s时其正突变率达到104%，是最高的，所以150s诱变时间比较合适。

四、讨论

枯草芽孢杆菌抗均蛋白对很多病菌都有抑制或杀灭作用，实验中对的拮抗作用进行了研究。结果表明，枯草芽孢杆菌大肠杆菌拮抗作用较为明显。在农林和经济作物的病虫害防治以及蓄禽、水产养殖中传染病的防治方面，芽孢杆菌及其抗菌物质展现了良好的应用前景。利用芽孢杆菌尤其是枯草芽孢杆菌进行生物防治或者生产微生物杀菌剂以代替剧毒化学药品是一种可行的策略。

参考文献：

[1] 彭益强、吕风萍、贺淹才等，激光诱变筛选高产植酸酶黑曲霉菌株的研究[J]，激光生物学报，2002

[2] 石春芝、陶天中、岳莹玉，神农架自然保护区大九湖芽孢杆菌资源调查[J]，氨基酸和生物科学，2003

[3] 南庆贤、戴瑞彤，中国肉制品微生物安全问题[J]，肉类研究，2004

[4] 韩建荣、董仙芳， 激光诱变青霉 PT95原生质体选育类胡萝卜素高产菌株[J]，微生物学通报，2002

[5] 陈天游、董思国、田万红、袁佩娜、曾明，枯草芽孢杆菌活菌体外拮抗6种肠道致病菌的研究[J]，微生物学杂志，2004

[6] 钟青萍，纳豆菌及其抗菌蛋白的研究，博士论文：南昌大学博士论文，2001