补体C3在周围神经再生条件液中的存在及其神经生物学活性的研究

孟繁君 李青峰 李玉萍 谢 峰 昝 涛 郑 丹 宁翁瑞 杨 湄 李 华

补体C3在周围神经再生条件液中的存在及其神经生物学活性的研究

孟繁君 李青峰 李玉萍 谢 峰 昝 涛 郑 丹 宁翁瑞 杨 湄 李 华

目的鉴定分析神经再生条件液(Nerve regeneration conditioned fluid，NRCF)中相对分子质量为(232～440)×103区域的蛋白条带，并探索NRCF中补体C3可能的促神经再生作用。方法采用Shotgun蛋白质组学策略、液相色谱一串联质谱对相对分子质量为(232～440)×103区域的蛋白条带的组分进行定性分析。在原代培养的皮层神经元中分别加入不同浓度的外源性补体C3蛋白和神经生长因子，以Neurolucida神经元分析软件采集各实验组每个大脑皮层神经元最长突起长度。结果NRCF中相对分子质量在(232～440)×103的蛋白条带共鉴定到54种蛋白质，其中包括补体C3 α链，补体C3 α链和神经突起导向因子Netrins结构中都含有一个共同功能域NTR组件。培养液加入特定浓度补体C3 (0.5～5 μg/mL)后培养96 h的神经元突起长度较正常对照组显著增长（P＜0.05）。结论补体C3存在于NRCF中，特定浓度补体C3对神经元突起有明显促进生长作用，NRCF中的补体C3可能对神经的再生有促进作用

神经再生条件液神经再生补体C3神经突

周围神经损伤时,在神经远、近两断端间桥接一硅胶管，形成的密闭间隔称之为神经再生室。再生室所形成的再生微环境及其中的主要成分—神经再生条件液(Nerve regeneration conditioned fluid，NRCF)，是神经再生自我调控、自我完善机制充分发挥的重要条件[1]。在我们前期工作中用鸟枪(Shotgun)蛋白质组学策略对NRCF中相对分子质量在(232～440)×103条蛋白带进行质普分析并进行了生物学分类，证实了Shotgun蛋白质组学策略对NRCF中蛋白成分分析的有效性和可行性[2]。我们在对NRCF中蛋白成分分析的基础上，利用蛋白数据库筛选有神经生物学活性的蛋白，发现NRCF中含有补体C3 α链，提示补体C3在NRCF中的存在[5]。

补体作为免疫系统的重要组成部分，在参与机体抗微生物防御反应以及免疫调节中发挥重要作用，补体C3是血浆中浓度最高的补体蛋白(1.0～1.2 mg/mL)。近年来，研究表明补体C3和其激活片段C3a在中枢神经系统中有着许多与免疫无关的作用：补体C3活性片段C3a和其受体C3aR对小脑发育过程中神经细胞的迁移有重要影响[3]。补体C3基因缺陷的小鼠大脑神经元无论是发育过程中还是脑缺血性损伤后的增殖能力明显下降[4]。但补体C3是否与周围神经的修复有一定联系，以及是否对神经元突起的生长有促进作用，却鲜有报道。我们进行补体C3对神经元突起生长影响的研究，发现特定浓度的补体C3对神经元突起有明显的促进作用，提示补体C3可能对神经的再生有促进作用。

1 材料与方法

1.1 材料

新西兰大白兔6只，体重1.8～2.5 Kg，雌雄不限（上海交通大学医学院附属第九人民医院动物实验室提供），SD大鼠胚胎（胎龄16 d)（孕鼠由中国科学院上海生命科学院动物中心提供）。

内径3 mm外径5 mm硅胶管(上海新亚医用橡胶厂)；聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂（Bio-Rad公司）；自然胶电泳高分子量标准试剂盒(Amersham公司)；神经元基础培养液Neurobasal Medium、2.5 S-神经生长因子（Invitrogen公司）；其余神经元培养用试剂均购自Gibco公司；Complement C3（Calbiochem公司）；小型垂直平板电泳设备（Bio-Rad公司）；LCQ DECA XP plus及Sequest软件（Thermo Finnigan公司）；C18反相柱（180 mm×150 mm×5 μm）（Thermo Hypersil-Keystone公司）；6孔细胞培养板（Corning公司）；聚丙乙烯塑料离心管（NUNC公司）；超净工作台（上海净化设备厂）；水平离心机（Heraeus公司）；恒温CO2培养箱（Heraeus公司）；解剖显微镜（Leica公司）；倒置显微镜（Olympus公司）；Scion Image分析软件（Scion公司）。

1.2 NRCF蛋白组分分析

1.2.1 实验动物与模型的建立

速眠新、氯氨酮肌注麻醉大白兔后，手术暴露双侧坐骨神经。游离坐骨神经约50 mm，从中间剪断，两断端用7-0缝线吻合已消毒的医用硅胶管1根(内径3 mm、长40 mm)。中间间隙为25 mm，形成约100 μL的兔坐骨神经再生室模型，6只大白兔共建立12个再生室模型。

1.2.2 NRCF自然聚丙烯酰胺凝胶电泳(Nativepolyacrylamide gel electrophoresis，Native—PAGE）分析

术后7 d，用50 μL微量注射器抽尽神经再生室中NRCF，每一个神经再生室抽得NRCF 50～100 μL，共获取约900 μL。分别置入无菌Eppendorf管中，每管150 μL，-70℃低温保存备用，Native-PAGE电泳均采用上述获取的NRCF样品。配制非变性PAGE分离胶和非变性PAGE浓缩胶，取高速离心后样品上清10 μL，加入2.5 μL的5倍加样缓冲液混合后上样，并同时加入非变性胶的高相对分子Marker 10 μL，12 mA条件下电泳30 min，然后15 mA电泳直至溴酚蓝到达底部前沿，电泳全过程在冰浴中进行。考马斯亮蓝R-350考染。以上电泳实验重复3次。

1.2.3 （232～440）×103区域的蛋白条带的鸟枪蛋白质组学分析

切取相对分子质量在（232～440）×103区域的蛋白条带约300 μg，将其溶于100 μL变性溶剂(6 mol/L盐酸胍，50 mmol/L Tris-HC1缓冲液，pH 8.3)，加入1 mol/L二硫苏糖醇1 μL，37℃，2.5 h；加入1 mol/L碘乙酰胺5 μL，室温，避光，40 min。置入截留分子量为3 000的超滤管，加入100 mmol/L NaHCO3200 μL，4℃，12 000 r/min超滤1.5 h；重复上述步骤3～4次，最后超滤至膜上溶液少于20 μL。取新的套管，倒置超滤管，12000 r/min离心约5 min。将超滤好的样品用100 mmol/L NaHCO3稀释至100 μL，混合，离心。加入约6 μg胰蛋白酶(Promega，37℃，18～20 h）置入截留分子量为10 000的超滤管，4℃，12 000r/min超滤1 h，将膜上液体超滤除去。将超滤至套管中的溶液冻干至少于15 μL。

上样进行LC-MS(仪器型号为LCQ DECA XP-plus)：用0.1%甲酸将样品稀释至51 μL，上样3次。RP-C18反相柱(180 μm×150 mm×5 μm），流速200 μL/min，分流比1:100，溶液A(0.1甲酸)，溶液B (0.1乙氰)，梯度360 min线性2%～85%。采用1个全扫描后紧跟3个MS的模式，得到电喷雾离子化(Electrospray ionization，ESI)质谱总离子流图谱和二级质谱图谱。应用Sequest软件分析质谱数据，对照国家生物技术信息中心(Mational center for biotechnology information，NCBI)LAGOMORPHA(兔形目)蛋白数据库。Sequest结果：过滤参数为，当Charge+1，Xcorr≥1.9；当Charge+2，Xcorr≥2.2；当Charge+3，Xcorr≥3.75；其中DelCN≥0。

应用同源性搜索、结构预测和结构鉴定等方法筛选鉴定结果的54种蛋白质中可能具有神经生物活性的蛋白。根据Identified Name（包括gi、sp、gb、emb、pir、prf、dbj、pdb等）在InterPro、SMART、Pfam等蛋白质数据库中查询分析。

1.3 补体C3对神经元突起的影响的观测

1.3.1 皮层神经元分离及原代培养

取孕16 d的SD大鼠，乙醚麻醉后取胚胎；解剖镜下解剖出大脑皮层，去脑膜；剪碎大脑皮层，加0.05%胰蛋白酶于37°C孵育箱消化10 min，接种培养基（DMEM+10%胎牛血清+5%马血清）中止消化后，将组织吹打悬浮成单细胞，以1×104cells/cm2接种于已置入包被好玻片的6孔培养板，第2天更换后续培养基[Neurobasal Medium+2%B-27 Supplement +Glutamine（2 mmol/L）]。

1.3.2 神经元分组处理

分组：①正常对照组，不加入其他试剂；②NGF阳性对照组，细胞培养第2天加入神经生长因子NGF，终浓度为100 ng/mL；③补体C3实验组：细胞培养第2天加入补体C3，终浓度为：0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL。

各组在37℃、5%CO2条件下孵育培养，每日更换新鲜培养液并重新加入各自相应实验因素，培养至96 h。从各实验组随机选取生长良好、神经突与周边细胞无交错的神经元，每组各300个，分3次实验。用Scion Image分析软件采集各组大脑皮层神经元的突起长度。

1.4 数据分析和统计

数据以（均值±标准误）表示。进行单因素方差分析(Oneway-ANOVA)，实验组各种浓度结果均与对照组之间行组间两两比较，P＜0.05代表有统计学意义，P＜0.01代表有高度统计学意义。

2 结果

2.1 Native-PAGE电泳结果

重复3次电泳得到的NRCF蛋白质图谱非常相似。NRCF经Native-PAGE电泳分离，相对分子质量在669×103以上有1条蛋白带，在相对分子质量为(67～669)×103区域存在多条蛋白带(图1)，相对分子质量在(232～440)×103有1条蛋白带，相对分子质量在(140～232)×103有1条蛋白带，相对分子质量在(67～140)×103有6条蛋白带，在含量上占NRCF的大部分。

2.2 Shotgun蛋白质组学鉴定

针对Native-PA GE胶上相对分子质量在(232～440)×103的蛋白条带，切胶酶解，进一步使用电喷雾离子阱质谱（ESI-IT-MS）进行Shotgun蛋白鉴定，获得该蛋白条带的ESI质谱总离子流图谱和二级质谱图谱；Sequest软件分析质谱数据，比对NCBI LAGOMORPHA蛋白数据库，共鉴定到54种蛋白，其中含有补体C3 α链，其质谱ig号为116596，鉴定肽段数为81，唯一肽段数为21，这表明NRCF中含有补体C3[5]。对鉴定到的54种蛋白质在InterPro、SMART、Pfam等数据库中应用同源性搜索、结构预测和结构鉴定等方法筛选具有神经生物活性的蛋白。结果发现在本实验质谱结果中的C3 α链与已知的神经突起生长导向因子（Netrins）C端具有同源性功能域NTR组件。

2.3 补体C3对神经元突起生长的影响

神经元培养第2天，见绝大多数神经元形态饱满，状态良好，部分神经元有细小突起长出。培养后96 h镜下示各组神经元突起已经非常明显，其中补体C3 0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL浓度组、NGF阳性对照组各组间神经突无明显差别，但明显较正常对照组和其它C3浓度组神经元生长状态更为旺盛，突起更长（图2）；补体C3 0.1 μg/mL、0.2 μg/mL浓度组、正常对照组间神经突无明显差别。

2.4 数据分析和统计结果

3次实验图像测得正常对照组、NGF阳性对照组、补体C3 0.1 μg/ml、0.2 μg/mL、0.5 μg/ml、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL浓度组神经突平均长度分别为420.78 μm、485.79 μm、428.95 μm、430.46 μm、480.12 μm、567.82 μm、574.60 μm、569.24 μm。统计学Oneway-ANOVA分析，NGF阳性对照组、补体C3 0.5 μg/mL浓度组神经元突起与正常对照组间差异有统计学意义(P＜0.05)，平均长度较正常对照组分别增长14.2%和15.4%，补体C3 1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL浓度组神经元突起长度与正常对照组间有高度统计学意义（P＜0.01），平均长度较正常对照组分别增长34.9%、36.5%和35.2%，但补体C3 1.0 μg/ml、2.0 μg/ml、5.0 μg/ml浓度组间差别无统计学意义；0.1 μg/ml、0.2 μg/ml与正常对照组神经间差别无统计学意义（P＞0.05）（图3)。

图1 神经再生条件液的自然胶电泳图谱

图3 培养96 h各组神经元神经突长度比较

3 讨论

周围神经损伤的修复与再生是一个复杂的生理过程，虽然显微缝合技术可以较好地恢复神经的连续性，但神经功能的恢复仍不令人满意[6-7]。随着近年来分子生物学研究的深入，人们发现神经再生具有自我调控和自我完善的能力，而再生微环境则是这一能力发挥与否的关键[8]。由Lundborg等[9]最早提出的神经再生室模型，为研究周围神经损伤后的再生机制提供了一个相对隔离的微环境，是公认的研究周围神经再生微环境的良好工具，然而目前对神经再生室内微环境的作用机制尚不清楚。NRCF体现了早期周围神经再生微环境的特征，使对NRCF的研究成为神经再生机制的一个重要途径[10]。本实验对NRCF中微量蛋白成分的分析有助于了解NRCF的性质和作用，为进一步寻找NRCF中能促进神经再生的蛋白，从而为改进目前的神经修复治疗方法奠定基础。

图2 培养96 h后，各组神经元生长情况（100×）

由于NRCF中的蛋白成分极其微量，对其分离和检测十分困难。目前对于NRCF的分析,大多停留在对其中某种或几种成分的分析，尚罕见对再生微环境进行总体的、系统的分析和报道。李青峰等[11]采用Native PAGE分离NRCF中蛋白成分，将含有不同蛋白条带的电泳凝胶块分别与背根神经节共培养进行活性鉴定，发现在含有相对分子质量为（232～440）×103间的蛋白具有明显的神经营养和趋化活性，能促使后根神经节突起向其生长。因此，我们的实验对该目标蛋白作进一步研究分析。

LC-MS／MS联用，即鸟枪蛋白质组学策略分析鉴定蛋白质混合物，是近年来发展迅速的非凝胶新方法[12]，是将蛋白质酶解片段混合物先后通过不同的色谱柱(如离子交换柱和反相柱)分离，分离的肽片段直接进入质谱仪进行一级质谱和二级串联质谱分析，得到肽段质量和部分碎片离子及序列的信息，最后通过计算机处理和联网查询对蛋白质进行鉴定[13]。前期工作中我们已经应用鸟枪蛋白质组学策略对NRCF中相对分子质量为（232～440）×103间的目标蛋白条带进行了成分鉴定和生物学分类[2]，现在我们在原来鉴定出的蛋白成分基础上，在蛋白质数据库中应用同源性搜索、结构预测和结构鉴定等方法筛选具有神经生物活性的蛋白。结果发现本实验鉴定出的54种蛋白成分中包含有补体C3 α链。补体C3激活前由α链和β链经二硫键相连组成，补体C3α链是补体C3特有的蛋白条链，补体C3 α链的存在表明NRCF中含有补体C3[5]。由于神经再生室是神经两断端间的密闭腔隙，故NRCF中补体C3应来源于神经断端的分泌而非神经外的免疫系统。

在蛋白质数据库中应用功能域筛选发现补体C3样因子的C末端和神经突起生长导向因子家族Netrins的C末端存在同源性的功能域NTR组件。Netrins在神经系统发育过程中具有促进和导向神经突起的作用，而其功能域NTR组件在该过程中发挥关键作用[14]。NTR在补体C3中的存在提示补体C3可能具有和Netrins相似的神经生物学活性。大量研究表明，补体C3在神经元生长和神经系统发育中有着积极作用。Heese等[15]发现人神经胶质细胞体外培养时，加入C3a能促使其表达神经生长因子，具有促进神经元生长的作用；Van Beek等[16]发现，C3a可以在有星形胶质细胞存在时，保护神经元免遭NMDA-兴奋性毒素的损害。Wyss-Coray等[17]也证实补体C3可以减轻神经损伤后的病理改变，提示补体C3可能也具有神经保护性；Rahpeymai等[4]发现补体C3或补体C3aR基因缺陷的小鼠的大脑室下区、海马齿状回颗粒层和嗅球区的神经增殖数目较正常小鼠有明显下降，脑缺血性梗塞小鼠模型梗塞周边区也观察到类似现象。但目前补体C3对神经元突起（轴突和树突）的生长速度有无直接影响尚不清楚。我们在培养的原代皮层神经元中加入补体C3，发现特定浓度（0.5～5 μg/mL）的补体C3对体外培养神经元突起的生长具有明显的促进作用，提示NRCF中的补体C3可能对神经损伤后的再生具有重要意义，但此结论尚需在体内实验中获得证实，有待于进一步的深入研究。

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Investigation on the Detection of Complement C3 and Its Neurobiological Character in Nerve Regeneration Conditioned Fluid

MENG Fanjun,LI Qingfeng,LI Yuping,XIE Feng,ZAN Tao,ZHENG Danning,WENG Rui,YANG Mei,LI Hua.
Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:LI Qingfeng.

ObjectiveTo explore the effects of promoting nerve regeneration of complement C3 in nerve regeneration conditioned fluid(NRCF).MethodsThe protein band of the relative molecular mass of(232-440)×103in NRCF were analyzed by the Shotgun technique,liquid chromatography and mass spectrometry(LC-MS/MS).The primary cultured cortical neurons were exposed to different concentrations of exogenous complement C3 and nerve growth factor(NGF).Photograph of neurons in each group was taken every day,and the length of the longest neurite of each neuron was calculated by a neuron morphology analysis software.The neurons without exposure to the other agents and the culture fluid were served as controls.Results54 proteins were identified in the protein band of the relative molecular mass of(232-440)×103.Complement C3 alphachain protein,which had a NTR module as well as netrins in structure,was included in these proteins.The neurites of neurons with the presence of low C3 concentrations were significant longer than the neurites of normal control group after cuturing 96 hours.ConclusionThere was complement C3 protein in NRCF.Low concentration of complement C3 has positive effect on neurites growth in cultured rat cortical neurons.It implied that the complement C3 has a positive effect of promoting nerve regeneration in NRCF.

Nerve regeneration conditioned fluid(NRCF);Nerve regeneration;Complement C3;Neurite

R622+.3

A

1673－0364（2009）－01－0016－05

2008年11月22日；

2009年1月29日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.01.005

国家自然科学基金（30471795）。

200011上海市上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科。

李青峰。