丝素蛋白人工神经导管的皮肤致敏实验

严小莉 赵亚红 赵微加 杨宇民

丝素蛋白人工神经导管的皮肤致敏实验

严小莉 赵亚红 赵微加 杨宇民

目的评价本实验室自制的丝素蛋白人工神经导管对皮肤潜在的致敏性。方法以ISO 10993-10:1995标准，采用最大剂量法，将白化豚鼠分为SF-NGC组、阳性对照(甲醛溶液)、阴性对照(生理盐水)3组，先进行预试验确定主试验各阶段的浓度，然后进行主试验。在激发阶段的敷贴物去除后24 h、48 h、72 h，观察记录各组动物激发部位的皮肤情况，按标准进行评分，并算出致敏率。结果丝素蛋白人工神经导管的皮肤反应记分为0，致敏率为0。结论在试验条件下丝素蛋白人工神经导管无潜在的皮肤致敏性。

丝素蛋白人工神经导管生物相容性皮肤致敏试验

蚕丝，是最早被利用的动物蛋白质之一。由于具有良好的力学性能，其作为生物材料的应用也具有悠久历史，尤其是来自Bombyx mori蚕属的蚕丝早在100多年前就被编织成手术缝线[1]。最近，蚕丝的核心蛋白——丝素，在生物医学方面的应用正在被不断开发，尤其是近年来广泛地应用于组织工程学方面的研究[2-3]。本实验室成功自制了丝素蛋白人工神经导管，并对其生物相容性及其对大鼠坐骨神经的修复功能进行了一系列研究[4-5]。本研究以ISO 10993-10:1995标准，对本实验室自制的丝素蛋白人工神经导管的潜在致敏作用进行评价。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂

弗氏完全佐剂（Sigma公司）；十二烷基硫酸钠（AR，上海生化试剂有限公司）；多聚甲醛（AR，国药集团试剂有限公司）；丝素蛋白人工神经导管（本实验室自制）。

1.1.2 实验动物

健康的初成年白化豚鼠，体重为300～500 g，雌雄不限，雌鼠为未产并无孕（南京市江宁区青龙山动物繁殖场）。总数量为80只，其中14只用于确定皮内诱导的浓度，21只用于确定局部诱导和局部激发的浓度，45只用于主试验。

1.1.3 实验分组

共3组，分别是SF-NGC(丝素蛋白人工神经导管)组、阳性对照组、阴性对照组。规格为：内径1.8 mm，外径4 mm。阳性对照为甲醛溶液，阴性对照为生理盐水。

1.1.4 材料浸提液的制备

丝素蛋白人工神经导管经过121℃高压灭菌20 min，将材料分别以12 cm2/mL、6 cm2/mL、3 cm2/mL的标准浸入生理盐水，在培养箱中(37±1)℃条件下静置(72±0.5)h，制成高、中、低3种剂量的浸提液，并于12 h内用于试验。阳性对照：甲醛配制成浓度为6%、5%、4%（w/v）的水溶液。

1.2 方法

1.2.1 确定主试验皮内诱导阶段的浓度

将SF-NGC以12 cm2/mL、6 cm2/mL、3 cm2/mL的标准制浸提液，每种浓度的浸提液在动物去毛的肩胛骨内侧成对进行皮内注射，每点注射0.1 mL。每种浓度用2只豚鼠。6%、5%、4%（w/v）的甲醛水溶液3种浓度同法进行试验。观察各动物的局部及全身情况。主试验皮内诱导阶段所选择的最高浓度，以不导致皮肤大面积损伤及对动物产生其它有害作用为标准。2只动物皮内注射生理盐水作阴性对照。

1.2.2 确定主试验局部诱导阶段和局部激发阶段的浓度

将SF-NGC以12 cm2/mL、6 cm2/mL、3 cm2/mL的标准制浸提液，分别浸透滤纸片后贴敷于动物去毛的腹侧部，用封闭式包扎带包扎固定。每种浓度用3只豚鼠。24 h后除去包扎带和滤纸片。6%、5%、4%（w/v）的甲醛水溶液3种浓度同法进行试验。3只动物用生理盐水同法进行试验作为阴性对照。在可能的情况下，以可导致动物轻度红斑，但不对动物产生其他有害作用的浓度为主试验局部诱导阶段的浓度。选择不产生红斑反应的浓度为主试验局部激发阶段的浓度（表1）。

表1 各组在主试验各阶段的浓度

1.2.3 主试验

第1天，提取白化豚鼠45只，分成3组，每组15只，开始适应环境。第7天，在胸廓的背前区备皮4 cm×6 cm。

第8天，在每只动物去毛的肩胛骨内侧部位成对皮内注射0.1 mL。其中靠近头部的2点注射弗氏完全佐剂与生理盐水的等体积混合液；中间2点注射预试验时表l确定的浓度的浸提液，阴性对照组则注射生理盐水；靠近尾部的2点注射前2种注射液的等体积混合物。

局部诱导阶段7 d的观察发现，除阳性对照组外，其余各组均未产生刺激反应。遂在局部诱导斑贴前(24±2)h(即第14天)，在未产生刺激反应的豚鼠的试验区用10%十二烷基硫酸钠石蜡液预处理，按摩导入皮肤。第15天，各组分别用表1选定的浓度，将20 mm×40 mm滤纸浸透后贴敷于每只动物的肩胛骨内侧部位诱导注射点。封闭式包扎带包扎固定。(48±2)h后去除包扎带和滤纸片。对照组动物使用溶剂同法操作。

第28天，动物的单侧腹部用电动剃刀剃刮毛发4 cm×6 cm范围。第29天，用表l选定的激发阶段的浓度，浸透滤纸片，贴敷于每只豚鼠的单侧腹部。封闭式包扎带包扎固定。(24±2)h后去除包扎带和滤纸片。

除去敷贴后24 h、48 h、72 h观察试验组和对照组动物激发部位的皮肤情况。按如下评分标准评价红斑和水肿反应程度：无红斑：0分；极轻微红斑：1分；红斑清晰：2分；中度红斑：3分；重度红斑至轻微焦痂形成：4分。无水肿：0分；极轻微水肿：1分；水肿清晰：2分；中度水肿：3分；重度水肿：4分。

2 实验结果

2.1 动物活体观察

各组动物活动正常，饮食正常，敷料包扎固定良好，无移位。

SF-NGC组：各动物在去除敷料后24 h、48 h、72 h的观察结果都是无红斑、无水肿。

阳性对照组：各动物在去除敷料后24 h均为中度红斑至轻度结痂形成，中度水肿；48 h为中度红斑至轻度结痂形成，水肿清晰；72 h为中度红斑至轻度结痂形成，极轻微水肿。

阴性对照组：各动物在去除敷料后24 h、48 h、72 h的观察结果都是无红斑、无水肿。

2.2 各组皮肤反应记分结果

按ISO 10993—10:1995的皮肤反应分类系统对各组皮肤反应记分结果见表2。结果显示阳性对照甲醛溶液的致敏率为100%，皮肤反应平均记分为6，表明它具有致敏性。

SF-NGC组与阴性对照组的皮肤致敏反应平均记分均为0，致敏率为0，表明本实验室自制的丝素蛋白人工神经导管在试验条件下对皮肤无潜在致敏性。

表2 各组皮肤致敏率和皮肤反应记分

3 讨论

当外周神经受到长距离损伤时，必须要有合适的桥接物连接两断端。从而使近端神经沿着正确的方向生长，选择合适的桥接物成为目前神经科学及材料科学共同关注的焦点[6]。过去曾研究以自体或异体的组织作为桥接物，但存在很多困难，如供体缺乏、免疫排斥反应等[7]。因此，寻找一种合适的人工组织材料作为桥接物成为目前神经再生研究的关键之一。

丝素蛋白具有良好的生物力学性能；有一定的可降解性，且降解产物主要为游离氨基酸等[8]；与背根神经节[9]及海马神经元[10]都有较好的生物相容性。因而，本实验室构建了丝素蛋白神经导管，用于神经损伤修复的研究。

依据医疗器械生物学评价标准，医用材料需进行生物学评价，根据不同的临床应用，选择不同的生物相容性试验。皮肤致敏试验是丝素蛋白神经导管必须要进行的生物学评价之一。采用豚鼠测试皮肤致敏的方法有多种，最常用的两种方法是最大剂量法（Magnusson&Kligman）和封闭斑贴法（Buehler），只需采用其中一种方法即可。最大剂量法为最敏感和首选的方法。本试验以ISO 10993-10:1995标准，采用最大剂量法。评估得出：丝素蛋白神经导管在试验条件下无潜在致敏性。当然，动物实验对于材料的致敏性检测只是初步的评价，确切的结论还需结合人体的临床应用情况。

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[2]Altman GH,Horan RL,Lu HH,et al.Silk matrix for tissue engineered anterior cruciate ligaments[J].Biomaterials,2002,23(20):4131-4141.

[3]Altman GH,Diaz F,Jakuba C,et al.Silk-based biomaterials[J]. Biomaterials,2003,24(3):401-416.

[4]Chen X,Yang Y,Wu J,et al.Biocompatibility studies of silk fibroin -based artificial nerve grafts in vitro and in vivo[J].Prog Nat Sci, 2007,17(9):1029-1034.

[5]Yang Y,Ding F,Wu J,et al.Development and evaluation of silk fibroin-based nerve grafts used for peripheral nerve regeneration [J].Biomaterials,2007,28(26):5526-5535.

[6]Ichihara S,Inada Y,Nakamura T.Artificial nerve tubes and their application for repair of peripheral nerve injury:an update of current concepts[J].Injury,2008,4:29-39.

[7]Ciardelli G,Chiono V.Materials for peripheral nerve regeneration [J].Macromol Biosci,2006,6(1):13-26.

[8]Wang Y,Kim HJ,Vunjak-Novakovic G,et.al.Stem cell-based tissue engineering with silk biomaterials[J].Biomaterials,2006,27 (36):6064-6082.

[9]陈雪梅,杨宇民,王鸿逵,等.丝素纤维与背根神经节体外生物相容性初步研究[J].交通医学,2006,20(5):489-491.

[10]汤欣,杨宇民,丁斐,等.丝素纤维与海马神经元的生物相容性细胞培养研究[J].交通医学,2006,20(5):491-493.

Skin Sensitization Test of Silk Fibroin-based Nerve Guidance Conduit

YAN Xiaoli,ZHAO Yahong,ZHAO Weijia, YANG Yumin.
Jiangsu Key Laboratory of neuroregeneration,Nantong University,Nangtong 226001,China.

ObjectiveTo study the sensitization of silk fibroin-based nerve guidance conduits（SF-NGCs）in vitro. MethodsAccording to ISO 10993－10:1995 standard,maximization test was conducted in guinea pig.The skin sensitization reactions,including erythema and oedema,induced by SF-NGCs,normal saline and formalin solution were observed and scored respectively at 24,48 and 72 h exposure of the infusion of the materials.The allergenic rates and mean response score were calculated.ResultsThe allergenic rates and score of skin reaction of SF-NGC was 0/15 and 0,those of norm al saline 0/15 and 0.The group of normal saline was 0/15 and 0,but the group of formalin solution was 15/15 and 5. ConclusionSF-NGC is safe without skin sensitization.

Silk Fibroin-based Nerve Guidance Conduit;Biocompatibility;Skin Sensitization Test

R392-33

A

1673－0364（2009）－01－0029－03

2008年11月30日；

2009年2月5日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.01.008

国家自然科学基金（30770585），国家教育部“新世纪优秀人才支持”项目（NCET-07-0466），江苏省高校自然科学重大基础研究项目（07KJA31025）。

226001江苏省南通市南通大学神经再生重点实验室。

杨宇民。