去抗原异种松质骨材料的生物相容性研究

王德超 李 奎 崔冰宁 宇程峰

去抗原异种松质骨材料的生物相容性研究

王德超 李 奎 崔冰宁 宇程峰

目的研究去抗原异种松质骨支架材料的生物相容性，为其在骨缺损修复领域中的临床应用提供实验依据。方法对去抗原异种松质骨支架材料进行急性毒性实验、热源实验、溶血实验、凝血实验、兔肌肉内种植实验和兔桡骨骨缺损修复实验研究。结果去抗原异种松质骨支架材料无毒性、无热源性、不引起溶血和凝血反应，植入兔肌肉后逐渐发生生物降解并被纤维组织取代，兔骨缺损区植入后可被骨组织取代。结论去抗原异种松质骨支架材料具有良好的生物相容性，是理想的骨支架材料。

骨修复材料去抗原异种松质骨生物相容性组织工程

目前，治疗骨缺损的较理想方法是自体骨移植，但自体骨的来源困难，尤其是长骨缺损，是临床上亟待解决的难题之一。组织工程是应用生命科学和工程学的原理与技术，尤其是在细胞生物学原理基础上，充分利用现代生物材料,以修复和替代损伤的组织器官。研制理想的生物材料替代自体骨移植用于修复骨组织缺损，是医学和生物材料科学领域的一个重要课题。临床上已应用的骨移植物较多，如无机骨、羟基磷灰石、脱钙骨、脱蛋白骨以及各种各样的人工复合材料等，为临床骨缺损的治疗提供了很多选择。但是这些方法各有不足，难以满足临床上修复各种骨缺损的需要。异种骨来源广泛，取材方便。去抗原异种松质骨具有天然的多孔结构，形状规则，具有可塑性及一定的机械强度，容易加工成所需的形状并有支撑作用。去抗原猪松质骨支架材料作为骨组织工程支架的一种，具有良好的力学性质、空间结构、降解性、骨传导性、成骨诱导性等特点，日益受到重视，但其生物相容性尚未见报道。本研究对去抗原猪松质骨的生物相容性进行评价。

1 材料与方法

1.1 材料

去抗原猪松质骨材料制备：取新鲜猪股骨，去除软组织和骨髓后，锯成20 mm×10 mm×10 mm骨块，依次经过20%H2O2浸泡8 h；1:1甲醇/氯仿浸泡12 h；0.5%Triton X-100浸泡10 h；0.1%胰蛋白酶溶液（pH 7.8）中浸泡处理8 h；10%高渗盐水浸泡8 h；蒸馏水冲洗浸泡l2 h；50℃以下烘干；包封后60Co照射(20 KGy)36 h备用。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性试验

选健康小鼠10只，体重20～24 g，雌雄各半，随机分成2组，每组5只。将块状的猪去细胞骨在37℃水浴箱中用生理盐水持续浸泡24 h(材料重量与浸提介质容量的比例为0.1 g/mL)，制备材料浸提液，过滤除菌。实验组无菌条件下向每只小鼠腹腔内注入1 mL浸提液，对照组单纯注入等量生理盐水。观察72 h，主要观察记录动物神经系统、呼吸、步态、活动等不良反应症状及有无死亡。然后取心、肺、肝、脾、肾标本作常规组织学观察。

1.2.2 热源试验

用与急性毒性试验相同的方法制备和消毒去抗原猪松质骨浸提液。选健康4月龄新西兰白兔3只，体重2～2.5 Kg，饲养条件一致，氯胺酮+异丙嗪麻醉，测量肛温两次，间隔1 h，取平均值为正常体温。试验材料研成细粉末，按1 g/10mL比例制成生理盐水浸提液，过滤除菌。向每只兔耳缘静脉注入5 mL浸提液，注射后每隔1 h测量兔体温1次，共3次，以3次体温中的最高值减去正常体温，即为该兔的体温升高值。

1.2.3 溶血试验

取新鲜兔血用生理盐水释成2%兔血悬液，将材料浸提液、生理盐水（阴性对照）和双蒸水（阳性对照）各2 mL、试验材料2 g分别加入2%兔血悬液2 mL，每组各3份。37℃水浴1 h，肉眼观察有无溶血，随即离心，取上清液1 mL，在722型分光光度计于545 nm处测定吸光度值，计算溶血率。

1.2.4 凝血试验

取材料50 mg、100 mg、200 mg分别加入正常混合血浆中，用自动血液凝固仪于1 h内测定凝血酶原时间(PT)、部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶凝固时间(TT)和纤维蛋白原，观察材料对凝血功能的影响。

1.2.5 肌肉、骨内长期植入试验

取健康家兔15只，体重2.0～2.5 Kg，无菌条件下在距股骨髁关节面8～10 mm松质骨处作经髁横形截骨，复位后在髁间凹中心钻孔，插入一枚HA/PDLLA棒材固定，另取2 mm×2 mm×12 mm HA/PDLLA试件植入双侧骶棘肌内，术后动物自由活动，不用外固定。进行以下观察：于8周、16周、24周各处死5只动物，作X线摄片后取股骨远端、材料周围肌肉组织作常规组织学观察。

2 结果

2.1 急性毒性试验

动物一般情况良好，活动、食欲正常，呼吸平稳，无惊厥、瘫痪和死亡现象，心、肺、肝、脾、肾标本组织学观察未见组织和细胞的变性及坏死。按WHO化学物质急性毒性试验标准，说明材料按毒性分级属于无毒级。

2.2 热源试验

3只家兔体温升高均低于0.6℃，升高总值0.86℃，低于1.4℃的标准。材料浸提液热源检查符合规定标准。

2.3 溶血试验

实验组和生理盐水阴性对照组均无溶血现象，双蒸水阳性对照组全部溶血。实验组溶血率为1.9%，小于5%，说明该材料具有良好的血液相容性。

2.4 凝血试验

加入不同剂量颗粒样品后，血浆中4项指标均正常，说明材料对凝血功能无影响。

2.5 肌肉、骨内长期植入试验

去抗原猪松质骨在肌肉植入实验中，有溶解现象，包膜未增厚，未见多核巨细胞。骨内长期植入实验X线摄片见6周时骨折愈合，无畸形。材料在12周前可清晰显影。组织学观察3周时骨折端有明显骨痂生成，材料在髁部与骨组织直接接触，在髓腔中材料周围有明显新骨生成，无中性粒细胞、淋巴细胞聚集，偶见巨噬细胞。6周时骨折均愈合，炎性细胞减少。

3 讨论

骨缺损的修复是骨科的难题之一，国内外学者都在研究骨的替代材料以解决这个难题。骨组织工程概念出现后，引起广大学者的关注。骨组织工程学研究中，种子细胞及细胞载体的选择是极其重要的问题。其中生物材料具有不可替代的作用，它能为细胞的黏附、分化和增殖提供良好的三维空间。因此，理想的生物材料应具有良好的生物相容性、骨传导性、一定的骨诱导性、一定的抗负荷能力、可生物降解、有利于细胞贴附和血管长入，对细胞、组织等应无毒性、无刺激性、无致畸突性，有可加工性及可消毒性。异种松质骨具有天然密集孔，大小较均匀，孔的直径更接近天然孔；随着免疫学、生物化学的发展，经一系列化学处理后，其中的免疫原性成分基本上被去除，故一般不会引起排斥反应。

理想的骨组织工程细胞外基质材料应具有良好的生物相容性和可降解性，合适的三维多孔结构，较强的骨诱导性，良好的可塑性和适当的机械强度，尤其是作为管状骨的修复材料[1-2]。由于创伤、肿瘤、炎症等造成的大范围骨缺损是骨科难题之一。目前骨移植手术是最为常用且行之有效的方法。提供移植的材料多种多样，但理想的骨缺损修复材料，尤其是修复大段骨缺损的移植材料仍是骨科面临的重要课题。异种骨由于来源广泛和经济简便，在解剖形状、组织结构等方面具有无法比拟的优越性，一直是相关学者热衷于研制、改良、开发的植骨材料。然而，异种骨的免疫排斥反应妨碍植骨与骨缺损区域直接接触，破坏植骨成分，造成局部炎症反应，导致植骨吸收。

在消除异种骨的抗原性的同时，保留其诱导成骨能力，是人们所期望的。骨是一种复合组织，除骨细胞和骨基质之外，还有血管、神经、脂肪及残留的骨髓成分等，这些成分均具有免疫原性。刘玮等[3]用现代免疫组织化学方法结合新鲜不脱钙切片技术首先证实：皮质骨抗原性主要位于骨细胞和哈佛管内皮上，免疫酶染色棕色酶反应物主要集中在骨细胞周边和中央管周围基质上，推测抗原可能位于细胞膜上。罗卓荆等[4]通过对松质骨抗原性的研究发现，在骨小梁骨基质染色阴性，而骨细胞、成骨细胞、软骨细胞及骨陷窝等均有不同程度的阳性染色。细胞阳性染色的部位主要在胞浆中。也就是说，各种细胞成分仍是松质骨中抗原的主要成分。常用的去细胞方法有酶消化法、渗透溶液法和去污清洗法。异种骨经过脱蛋白、脱脂及脱细胞处理后抗原性降低，同时保留其特有的天然网状结构和骨矿支架，且与人的骨组织结构具有同源性，无机成分主要是羟基磷灰石，与人骨相同，具有较好的生物相容性。在具体制作工艺中，异种骨处理的无机与有机成分比至关重要。异种骨有机成分中很多非胶原的酸溶性蛋白具有免疫原性，去除不充分则保留较强抗原性，但去除过多胶原蛋白则材料易碎，影响生物力学强度。我们在总结以往制备工艺的基础上，尽量保留胶原纤维，去除非胶原蛋白、肽类及脂类、细胞等，以降低抗原性，同时保留力学强度。H2O2可消除非胶原蛋白，氯仿、甲醇去脂，除垢剂Triton X-100是非离子性除垢剂，同蛋白酶及高渗盐水一道具有脱细胞作用。Triton X-100属于非离子型表面活性剂，在溶液中稳定性强，能与细胞膜中的磷脂结合形成复合物，溶解于溶液中，同时其疏水端能和膜蛋白结合破坏细胞膜。高渗生理盐水是借助细胞内外渗透压的差别，致使细胞膜破坏，细胞从基质中分离，从而获得去细胞基质。蛋白酶用酶的消化破坏细胞膜和细胞器，细胞与基质分离，从而达到脱细胞目的。

生物相容性是指材料与机体之间相互作用产生各种复杂的生物、物理、化学反应，以及机体对这些反应的忍受程度。目前对生物材料的相容性评价方法主要有两类，一是动物体内实验，即将材料植入体内做组织学检查，观察材料及周围组织病理变化；另一类为体外试验，即用材料或浸提液研究材料对组织生长、代谢及增殖方面的影响。目前国内外尚没有形成统一的标准和方案，我们主要参考《生物材料和医疗器材生物学评价技术要求》[5]，选用了6个实验对研制的去细胞基质骨的生物相容性进行评价。本研究通过对去抗原猪松质骨进行急性毒性实验、溶血反应、凝血反应和热源实验检测发现该材料无毒性、无热源性、不引起溶血和凝血反应。本实验中，肌肉和骨长期植入试验动物伤口Ⅰ期愈合，无感染和窦道形成，组织学观察见骨折正常愈合，无抑制现象，组织反应温和，未见大量炎性细胞、巨噬细胞和多核巨细胞集聚，证明材料无毒性、无刺激性和致突变性，不会引起溶血或凝血，生物相容性好。从本实验结果分析，可以初步认为，自行制备的去抗原异种松质骨材料无毒性作用，具有良好的生物相容性，可望成为一种较理想的骨移植替代材料。

[1]Griffith LG.Emerging design principles in biomaterials and scaffolds for tissue engineering[J].Ann NY Acad Sci,2002,961:83-95.

[2]Chu TM,Holister SJ,Halloran JW,et al.Manufacturing and characterization of 3-D hydroxyapatite bone tissue engineering scaffolds[J].Ann NY Acad Sci,2002,961:114-117.

[3]刘玮,陆裕朴,胡蕴玉,等.异种植骨抗原性的免疫组织化学实验研究[J].中华骨科杂志,1989,9(1):53.

[4]罗卓荆,胡蕴玉,王茜,等.异种松质骨移植抗原分布的免疫组化研究[J].中国矫形外科杂志,1998,5(6):539-540.

[5]卫生部药政管理局.生物材料和医疗器材生物学评价技术要求[M].1997,1-44.

The Biocompatibility Study of Antigen-Extracted Xenogeneic Cancellous Bone Matrix

WANG Dechao,LI Kui,CUI Bing,NING Yu,CHENG Feng.
Department of Orthopaedics,The Second Affiliated Hospital of Luohe Medical College,Luohe 462000,China.

ObjectiveTo study the biocompatibility of antigen-extracted xenogeneic cancellous bone matrix for the clinical use in the bone reconstruction field.MethodsAcute toxicity test,pyrogen test,hemolysis test,hemopexis test,and long-term muscle and bone implant reaction were included in this study to evaluate the biocompatibility of antique-extrated xenogenetic cancellous bone matrix.ResultsAll results indicated that the material had no toxicity,and it did not cause hemolysis and hemopexis.The material is safe without pyrogen.It could be biodegradated and replaced by fibrous after implanting into muscle.It also could be replaced by bone tissue after implanting into bone defects in rabbits.Conclusion Antigen-extracted xenogeneic cancellous bone matrix has good biocompatibility.It is a kind of ideal scaffold material.

Bone repair material;Antigen-extracted xenogeneic cancellous bone matrix;Biocompatibility; Tissue engineering

R392-33

A

1673－0364（2009）－01－0032－03

2008年8月22日；

2008年11月16日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.01.009

462000河南省漯河市漯河医学高等专科学校第二附属医院骨五科。