商陆抗病毒蛋白在植物抗病上的应用

陈国菊 雷建军 曹必好

（华南农业大学园艺学院，广东广州，510642）

商陆抗病毒蛋白在植物抗病上的应用

陈国菊 雷建军 曹必好

（华南农业大学园艺学院，广东广州，510642）

商陆抗病毒蛋白是指商陆属植物中的核糖体失活蛋白。阐述了商陆抗病毒蛋白的研究历史、意义、种类和理化性质，对病原菌的抗性、抗病机理及其在植物抗病上的应用情况等，并对它的应用前景作了展望。

商陆抗病毒蛋白 抗病 基因分离 转基因

1 商陆抗病毒蛋白的概念

商陆抗病毒蛋白 （pokeweed antiviral proteins，PAP），是商陆属（Phytolacca）植物的不同组织或不同生长阶段合成的一类具酶功能的碱性蛋白，属于Ⅰ型核糖体失活蛋白 （ribosome-inactivating protein I，RIP），对植物病毒、动物病毒、真菌、细菌有一定的抑制作用[1～6]。

前人对于PAP的研究，多数是以美洲商陆为研究材料，以商陆属的其他植物为研究材料的很少。事实上，早在1948年，Kassanis B等就从食用商陆叶片中分离和提纯了商陆抗病毒蛋白[11]。MoonY H等从叶片中分离PinPAP基因并且将其转化到马铃薯中[12]。

在其他的商陆属植物中也有这种蛋白的存在，所以pokeweed antiviral proteins,PAP，应该是“商陆抗病毒蛋白”而不是“美洲商陆抗病毒蛋白”。美洲商陆抗病毒蛋白（PamPAP）是指从美洲商陆中分离出来的抗病毒蛋白。

2 PAP的种类

目前从美洲商陆中分离得到数种抗病毒蛋白，统称为PamPAPs，随季节和植株部位的不同而形成不同形式。

纯化自美洲商陆中的PamPAP有6种：一种是在春季叶片上合成的PamPAP称为PamPAPI，其相对分子质量为29 kD，等电点为8.1；另一种是PamPAPII，产生于夏季叶片，其相对分子质量为30 kD，等电点为8.3；还有一种是晚夏的时候表达的蛋白，称为Pam-PAPIII，相对分子质量为30 kD；纯化自美洲商陆的种子的PamPAP叫PamPAP-S，相对分子质量为29 kD；而从美洲商陆的根部获得的PamPAP称为Pam-PAP-R[1～2，11～12]。此外，以PamPAP-S序列为引物，从种子中获得核基因组编码的抗病毒蛋白Pamα-PAP，这个蛋白与PamPAP-S类似但不相同，比PamPAP-S在氨基和羧基端分别多24和9个氨基酸残基[5]。Lin等将来自美洲商陆生长期叶片cDNA编码的抗病毒蛋白称为c-PamPAP[4]。

3 PAP对病原菌的抗性

3.1 PAP抑制植物病毒的活性

自Dugger B M等在1925年报道了美洲商陆汁液抑制黄瓜花叶病毒（CMV）和烟草花叶病毒（TMV）的研究[13]以来，随后有许多研究者对之进行了抗植物病毒的研究。从目前的报道来看，PAP属于广谱性抗植物病毒蛋白。

Chen Z C等报道，纯化自美洲商陆叶片中的PamPAP用枯斑寄主测试时，抗5种植物RNA病毒，即TMV、CMV、ALMV、马铃薯X病毒（PVX）和马铃薯Y病毒 （PVY）；用系统寄主测试时，它能够抗2种DNA病毒，即花椰菜花叶病毒（CaMV）和非洲木薯花叶病毒 （ACMV），同时还发现，在病毒侵染后再用PamPAP处理，则PamPAP不表现抗病毒活性，说明PamPAP只在病毒侵染的初期阻止病毒的复制[14]。

刘海礁等研究发现美洲商陆愈伤组织的蛋白提取液对TMV具有显著抗性[15]，为安全生产、高效的植物源抗病毒制剂提供了一定基础。

3.2 PAP抑制动物病毒的活性

PAP不仅对多种植物病毒具有广谱抗性，也可以抑制动物病毒活性，如对脊髓灰质炎病毒、流感病毒、人类免疫缺陷病毒（HIV-1）、I型单纯疱疹病毒等动物病毒都有抑制作用[6，11，16～17]。

Zarling J M等报道，PamPAP结合在单克隆抗体上，以CD4+细胞为靶细胞，从而抑制人类免疫缺陷病毒（HIV-1），在CD4+T细胞中的复制使得抗病毒能力提高1000倍[6]，显然这是一种人工免疫毒素起作用的特例，为开发定向杀死感染病毒细胞的人工药物提供了很好的启示。此外，在Vero和Hela细胞中培养的情况下，PamPAP对I型单纯疱疹病毒的复制具有抑制作用，这种抑制是由PamPAP缓慢进入受侵染细胞并导致了抑制效果的累积作用[17]。同样，PAPs也抑制I型单纯疱疹病毒[11]。

3.3 PAP抗真菌、细菌以及具有杀虫活性

PAP除了抗植物病毒和动物病毒活性以外，还对真菌和细菌的活性有一定的抑制作用。Zoubenko O等研究发现在表达PamPAP或无毒性PamPAP突变体的转基因烟草中可抵抗立枯丝核菌[18]。蒋妮等（2006）测定中国商陆等6种药用植物粗提物对扶芳藤稠李巢蛾的杀虫活性，结果表明，中国商陆根的提取物较之其他5种药用植物具有较好的杀虫活性，其胃毒活性强，还具有一定的触杀活性，6种药用植物中中国商陆最具有研究开发潜力[19]。

4 PAP的抗病机理

PAP作为一类从商陆属植物中提取的抗病毒蛋白，属于I型核糖体失活蛋白，实际上是一类同功酶，它们的酶活性可以特异地切断糖苷键，使真核细胞核糖体活性丧失，抑制蛋白质的合成，损伤细胞[20]。

核糖体失活蛋白是一类能够抑制蛋白质生物合成的蛋白毒素，在酶学分类上归入糖苷酶[21]，广泛存在于高等植物中，在真菌和细菌中也有分布。

PamPAP可使美洲商陆核糖体失活，对美洲商陆细胞有潜在的毒性，因此以原位自杀模式（local suicide model）作为美洲商陆中PamPAP的抗病毒机制，同时强调了PamPAP和细胞中核糖体在空间上的分离[22]。寄主核糖体的脱嘌呤和核糖体失活是PamPAP抑制病毒侵染的原因。在T细胞和巨噬细胞中，能够抑制HIV-1复制的PAP浓度并不影响蛋白质合成，但能够引起人类HIV-1和植物TMV的基因组RNA的脱嘌呤，由这一结果表明，PAPs的抗病毒活性也包括对病毒本身RNA的脱嘌呤作用[6，12～23]。

PAP具有不同的功能区：现已证明在成熟的PAP N-端第170～183个氨基酸为一个活性区域，保守性很强，其主要功能是对病毒产生抗性；在成熟的PAP C-末端1～25个氨基酸处的区域，主要功能是脱去rRNA的特异位点上的腺嘌呤，使其蛋白质合成受阻，致使细胞死亡。试验也证明，缺少C-末端1～25个氨基酸的PAP丧失了对寄主细胞的毒性，即不阻碍该细胞蛋白质的正常合成，但是仍然赋予该细胞对侵入病毒的抗性，而将活性区的某一个氨基酸突变之后，如将第176位的氨基酸E变成V，即可使其失去活性，也就丧失了对病毒的抗性[24]。PAP的毒性活性区与寄主细胞的毒性区彼此分离，因此可以通过基因改造，去其细胞毒性区而保留抗病毒活性区，即可发挥其实际利用价值。

PAP的细胞毒性已被许多学者所注意，他们设计用这类毒素来杀死癌细胞和肿瘤细胞[6，11，17]。其原理是通过一些特定的蛋白交联剂，PAP与某些癌细胞和肿瘤细胞或特定抗原的抗体相结合，可定向地杀死体内的癌细胞和肿瘤细胞。

5 PAP在植物上的应用

5.1 用于制备免疫毒素（Immunoty oxins）

从商陆属植物中分离到一系列抗病毒蛋白（PAPs）以及一些抗真菌蛋白，可以抑制多种植物病毒、真菌等活性。利用这一特性，可以制备免疫毒素用于植物病害的防治。

Dore J M等 （1993）采用PCR技术克隆了Pam-PAP的开放阅读框（ORF），研究了抑制真核生物的翻译过程，但对大肠杆菌无毒性的两个PamPAPI序列仅有1和2个位点发生突变，突变位点的氨基酸可能参与原核糖体的识别，因此，这两个PamPAPI突变体可用于构建免疫病毒[25]。

5.2 PAP基因克隆与表达

目前采用基因工程技术，已经成功克隆和表达了不同类型的PAPs。在Gene Bank中登录的PAP基因已经超过20个。

通过不同的引物设计，从商陆属植物中克隆得到了不同的商陆抗病毒蛋白基因，对其进行序列分析和表达研究[4，26～27]。刘迎芳等从美洲商陆种子中新发现一种抗真菌蛋白基因（Pa-AFP），将它转化到大肠杆菌中，融合蛋白被大量表达[28]。

5.3 转PAP基因作物

将PAP基因导入植物体内，受体可以产生对多种病毒的抗性，避免目前绝大多数抗病毒转基因植物只抗单个病毒而对多种病害没有抗性的局面。目前已通过转基因技术将不同的PAP基因导入到马铃薯、烟草、辣椒、番茄、油菜、水稻、草坪草、小麦和玉米等植物中，所获得的转基因植株，所抗病毒及其他病原菌的种类也比较多。但是有些PAP基因导入植物，转基因植株会有一些不良反应发生。

转PamPAP基因的烟草和马铃薯植株表现出对PVX、PVY和CMV机械接种病毒的抗性，同时也发现转基因植株较正常植株生长矮小[29]；而转Pin-PAP马铃薯植株表现出对PVX,PVY和马铃薯卷叶病毒（PLRV）等的抗性[10]。陈定虎等对PamPAP的基因进行缺失改造后，获得的转基因小麦、玉米、烟草、棉花分别对大麦黄萎病、玉米矮花叶病、烟草花叶和棉花黄萎病有不同程度的抗性[30]。陈国菊等从中国商陆中克隆的缺失无毒型PacPAP基因转化辣椒和番茄，转基因辣椒植株抗TMV和CMV，转基因番茄株系达到抗病级别[31～32]。Dai W D等将PamPAPC（成熟PamPAP C-端缺失25个氨基酸残基）、PamPAP-Y（将PamPAP123位的酪氨酸变成了丙氨酸）和PamPAPII分别转化到草坪草中，获得了抗核盘菌和立枯丝核菌的转基因植株，其中，转Pam-PAP-Y的植株生长状况良好而且抗病性稳定，转PamPAPII的植株生长势弱而且有一定程度的矮化现象 [33]。

6 展望

PAP作为一类具多种功能（抗植物病毒、抗动物病毒、抗真菌等）的蛋白，已引起人们的高度重视。

首先，在抗植物病毒、真菌等方面，由于还没有有效的抗病毒化学制剂，病原性的转基因工程植物存在一定的环境风险，因此，作为非病原的一类抗病毒蛋白基因，用作抗病毒的转基因材料，具有一定的优势。但是，PAP基因直接转基因存在一定的细胞毒性，因此，可以通过基因改造，去其细胞毒性区而保留抗病毒活性区，发挥其实际利用价值。

其次，PAP对多种动物病毒有抑制作用，特别是对HIV，使其在制备免疫毒素方面表现出了巨大的医疗潜力。

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Pokeweed Antiviral Proteins from Phytolacca and Its Application to Controlling Diseases in Plant

CHEN Guoju,LEI Jianjun,CAO Bihao

Pokeweed antiviral protein is a ribosome-inactivating protein inplants.The following topics are reviewed such as study history and significance of pokeweed antiviral proteins(PAP)fromThe correction of PAP concept,PAP kinds and physical and chemical characters,resistance to diseases,resistance mechanism,application to controlling diseases in plants,the future prospects are discussed.

Pokweed antiviral proteins;Disease-resistance;Gene isolation;Transgenic plants

10.3865/j.issn.1001-3547.2009.20.002

本研究获广东省自然科学基金项目（32293）资助

陈国菊（1967-），女，博士，副教授，主要从事蔬菜育种与生物技术研究

雷建军（1957-），通信作者，男，华南农业大学教授，博士，主要从事蔬菜育种与生物技术研究

2009-07-02