抑制性差减杂交结合基因芯片技术在植物基因差异表达研究中的应用

陈儒钢 巩振辉 逯明辉 李大伟 黄炜

（西北农林科技大学园艺学院，陕西杨凌，712100）

抑制性差减杂交结合基因芯片技术在植物基因差异表达研究中的应用

陈儒钢 巩振辉 逯明辉 李大伟 黄炜

（西北农林科技大学园艺学院，陕西杨凌，712100）

抑制性差减杂交技术和基因芯片技术是近年来发展起来的研究基因差异表达的2种非常有效的方法。SSH技术或基因芯片技术单独使用都存在不同程度的缺陷和不足，但若将2种技术结合起来使用，则能充分发挥各自的优势，并最大限度地弥补各自的不足。鉴于此，对SSH技术与基因芯片技术的原理与优缺点以及两者的结合在植物研究上的应用进行了综述。

抑制性差减杂交（SSH） 基因芯片 差异表达基因 应用

多细胞生物的正常生长、发育、代谢、繁殖和衰老以及逆境条件下组织细胞结构与功能的变化，归根结底是基因在一定时间上或空间上的选择性表达，即基因差异表达的结果。基因表达的变化是调控细胞生命活动过程的核心机制。了解不同条件下基因表达的种类差异，建立相关功能的基因表达谱，对于探究造成生物细胞表型差异的遗传原因、提供研究复杂生命过程的基本信息以及从整体水平研究代谢机制、了解基因的相互关系至关重要。抑制消减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）技术与基因芯片技术是新近发展起来的筛选差异表达基因的有用工具，对克隆不同组织细胞间或同一组织不同生理或病理状态下的差异表达基因，研究组织细胞的功能、抗病机制、植物各个器官发育等具有十分重要的意义。但2种方法单独使用均存在许多不足之处。为了取长补短，近年来很多研究者将这2种方法结合起来，作为一种新的策略共同用于差异表达基因的分离克隆，并取得了很好的效果。本文对抑制消减杂交与基因芯片技术的原理与优缺点以及两者的结合在植物研究上的应用进行综述。

1 抑制性差减杂交技术

抑制消减杂交技术是1996年由Diatchenko建立的以抑制性PCR为基础的cDNA消减杂交方法[1]。其依据的技术主要有两点：①消减杂交；②抑制PCR。经抑制消减杂交后的cDNA群体不仅富集了差异表达基因（目的基因），而且目的基因间丰度的差异经过均等化作用已基本消除，使消减后的cDNA群体为丰度一致的目的基因群体。其基本过程是：粗提2种不同细胞（tester和driver）的mRNA，反转录成cDNA，用4碱基识别酶 （RsaI）酶切2种cDNA产生平端片段；tester cDNA分别接上adapter1和adapter2，并与过量的经RsaI消化的driver样本杂交。根据复性动力学原理，丰度高的单链cDNA退火时产生的同源杂交速度快于丰度低的单链cDNA，从而使得丰度有差别的cDNA的单链分子的相对含量趋向一致。这时混合两份杂交样品，同时加入新的变性driver cDNA进行第二次消减杂交。杂交完全后补平末端，加入合适引物 （即adapter1和adapter2的部分特异序列）进行PCR扩增，只有含不同接头的双链DNA分子才可进行指数扩增，扩增产物即为目的片断。利用adapter上的酶切位点可进行克隆、测序等。

SSH技术巧妙地利用了抑制PCR扩增技术，克服了其他消减杂交技术的缺陷，具有许多明显的优越性：①假阳性率大大降低，这是它最大的优点。这是由它的两步消减杂交和两次抑制PCR所保证的。②高敏感性。SSH方法所做的均等化和目标片段的富集，保证了低丰度mRNA也可能被检出。③速度快，效率高。一次SSH反应可以同时分离几十或成百个差异表达基因。另外，此技术还具有背景低，重复性好的特点[2]。

同时，SSH也有一定的缺点：①SSH技术需要几微克量的mRNA，如果量不够，则低丰度的差异表达基因的cDNA很可能会检测不到，这是SSH技术不能被广泛应用的主要障碍。②SSH技术筛查获得克隆需Northern blot来鉴定验证，操作繁琐，效率较低。③SSH技术得到的cDNA是限制酶消化的cDNA，不再是全长cDNA，当然，这个缺陷可以通过筛选cDNA文库或者采用RACE的方法获得全长目的基因。④不能同时对数个材料之间进行比较，材料之间存在过多的差异及小片段缺失也不能被有效检测。

2 基因芯片技术（Gene Chips）

基因芯片，又称DNA芯片、DNA微阵列（DNA microarray），是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测，并用计算机系统分析，从而迅速得出所要的信息[3]。基因芯片具有高通量、高信息量、快速、并行检测、样品用量少、用途广泛等优点，已经被广泛应用到基因表达检测、突变检测、基因组多态性分析、基因文库作图以及杂交测序等方面。在研究基因差异表达时，通常使用的是cDNA芯片。

基因芯片与传统的膜杂交相比有以下优点：①芯片点样密度远远高于膜的点样密度，样品用量少，信息量大。②芯片可用双色荧光标记两种探针，这样大大提高了数据准确性；而膜通常用核素标记探针，一张膜只能杂交一种探针，数据可比性差；③芯片杂交体积小，灵敏度高；膜杂交体积大，灵敏度差；④芯片具有表面平整性好、硬度大、透明等特点，比易卷曲的膜杂交更容易在点样、杂交、图像处理及数据采集等方面自动化。基因芯片具有高通量、高信息量、快速、样品用量少、造价低、用途广泛等优点。但费用太高也限制了基因芯片的广泛应用，如果处理的样品太多，很难普及使用。同时基因芯片技术不能分离和鉴定未知基因，这也是限制其广泛应用的一个重要原因。

3 SSH结合cDNA芯片技术研究基因差异表达的特点

联合应用SSH和cDNA芯片技术研究差异表达基因，不仅具有2种技术各自的优点，弥补了传统方法的不足，而且在方法学上开创了克隆基因的新途径。

SSH技术通过两次消减使得丰度高低不一的mRNA得以均衡化；通过抑制PCR使得差异表达的基因得以指数扩增，而共有mRNA扩增得到抑制，从而能够筛查出低丰度的差异表达基因；同时SSH技术还能够分离和鉴定未知基因，而这些正是基因芯片技术无法完成的。因此，通过SSH均衡不同丰度的差异表达基因，可大大提高cDNA芯片发现低丰度差异表达基因和新基因的概率。但通过SSH技术筛查获得的几百甚至上千个差异表达克隆基因若都通过Northern blot来鉴定验证将是一项十分繁重且效率低的工作。而cDNA芯片具有高通量筛选的突出优点，将大量的靶基因高度集成在很小的载体上，因此可同时分析成千上万个基因的表达模式，而且从cDNA芯片的制备到信号的扫描分析多由仪器操作，自动化程度高，检测速度快，节省了大量的人力、物力和时间。因此将SSH与cDNA芯片技术相结合，可促进差异表达基因的大规模快速筛选，从而克服了传统用Northern blot对SSH构建的文库克隆进行筛选的低效性，并提高了cDNA芯片发现低丰度差异表达基因和新基因的概率[4～5]。

同样任何一种方法都会有其自身的局限性，SSH与cDNA芯片技术的结合也不例外，其具体表现为SSH技术由于需要较多的起始材料且更多地依赖于PCR技术，若mRNA量不够，则低丰度的差异表达基因cDNA可能检测不到，而且不能同时对数个材料之间进行比较，材料之间存在过多的差异及小片段缺失也不能有效被检测。因此，一次SSH技术分析不可能将所有的差异表达基因一网打尽，SSH结果具有相当的或然性。cDNA芯片虽然可以进行高通量筛选，但是却受到芯片容量的限制。此外，每次杂交需要大量的RNA，对于低拷贝数的mRNA需要量尤其大[4～5]。

4 SSH结合cDNA芯片技术在植物基因差异表达研究中的应用

Yang G P等在1999年首次将基因芯片技术用于分析SSH所得到的差异克隆的表达情况，通过Northern杂交这种传统的分子生物学技术证明，基因芯片与SSH技术相结合的方法可以高效地鉴定大量差异表达的基因[6]。自此以后，这种方法得到广泛的运用。在植物方面，这种方法主要应用于植物的抗逆性及植物发育的研究。

4.1 植物抗逆性的研究

植物在不同的逆境条件下都会表现出一定的抗性，分析不同逆境胁迫下的差异表达及分离克隆差异表达基因并进行功能分析，有助于阐明逆境调控通路，对进一步揭示逆境胁迫的分子调控途径具有重要的作用。Zheng J等将SSH与cDNA芯片技术相结合，研究干旱胁迫对玉米幼苗叶和根诱导表达基因的克隆与功能分析，鉴定了一大批玉米抗水分胁迫的基因，并发现了一些可能与水分胁迫下的信号转导相关的基因[7]。Tang W等研究了耐渍性不同的玉米在淹水胁迫下的基因表达差异，并发现了一个可能与缺氧胁迫有关的新基因[8]。Ouyang B等利用抑制差减杂交和芯片技术分析了番茄逆境响应的基因表达谱，结果表明，番茄在盐胁迫响应中，201个差异表达基因编码蛋白的可能功能可分为14大类。根据差异基因的数量，前5类为代谢、转录因子、功能未知、能量代谢和信号转导类[9]。Verica J A等将SSH结合cDNA芯片技术用于研究可可树的病害防御反应中由信号分子引起的信号转导途径的改变，获得了一大批上调或下调表达的基因[10]。Botha A M等（2006）用抗虫性不同的小麦近等基因系构建SSH文库，结合基因芯片技术发现了29个与抗虫性有关的基因，并认为小麦在受到蚜虫侵害后，维持光合作用以及产生相应能量的能力是小麦在虫害中是否能存活下来的决定因素[11]。

4.2 在植物发育方面的研究

生物体内大部分基因都是时空表达和诱导表达的结果，因此在植物不同发育时期，不同组织器官基因的表达不同。研究不同发育阶段、不同组织器官基因的特异表达，对于了解生物的生长、发育和衰老等基本规律具有重要的意义。Lee J M等人利用含有重要代谢途径和玉米幼胚cDNA克隆的芯片，研究玉米授粉后幼胚发育不同时期的基因表达变化，研究发现有一组基因在授粉后5～10 d,20～25 d,40～45 d内表达剧烈增加和授粉后表达逐渐减弱的基因，进而阐述玉米幼胚的发育规律[12]。Kim J Y等人用SSH筛选出香石竹花成熟过程中发育调控基因CFMI（Carnation flower maturationinduced），CFMI在香石竹花发育过程中有差异表达，并且优先在花瓣与花柱中表达[13]。Schena M等人对拟南芥根部和茎部差异表达基因的研究，阐述植物根部和茎部产生形态和功能差异的原因[14]。Le Q等[15]和Derory J等[16]也分别利用该方法研究比较了细胞分化不同阶段基因的表达情况和顶芽在萌发的不同阶段基因的表达情况。

5 展望

随着后基因组时代的到来，探索基因的功能逐渐成为热门的研究课题。借助生物信息学、基因组学、蛋白质学等学科的迅猛发展，数据库中成千上万基因的功能被开发出来。将SSH和cDNA芯片技术结合起来进行基因表达差异的研究，在相当长的一段时间内都会有重要的应用前景。SSH方法是寻找差异表达基因的快速有效的方法，cDNA芯片是高通量筛选基因表达的方法，将SSH和cDNA芯片技术相结合，不仅弥补了SSH后续大量差减克隆繁重、Northern blot鉴定的不足，而且能较为真实地反映RNA的丰度差异，大大提高了工作效率。虽然SSH和cDNA芯片技术的结合还存在花费较高，对于样本较多的研究对象很难普及的局限性，但是随着人类基因组计划和微生物全基因组测序的完成，SSH与基因芯片技术有机结合将促进差异基因的大规模快速筛选，而且筛选到的特异片段序列可与相应的基因序列库中的表达序列标签进行同源比较，或通过计算机分析查找到基因的全序列，进而推测、鉴定基因表达蛋白的功能。这将为植物差异表达基因的分离与鉴定、重要性状的基因克隆和功能分析、植物抗性机理等方面的研究提供新的手段，从而大大推动植物发育生物学、植物生理学和植物遗传学等学科的发展。随着技术本身的不断改进并将这2种技术集成使用，对差异表达基因的克隆具有十分广阔的应用前景。

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Application of Suppression Subtractive Hybridization Coupled with Gene Chip Technologies to Differential Expression Genes of Plant

CHEN Rugang,GONG Zhenhui,LU Minghui,LI Dawei,HUANG Wei

Suppression subtractive hybridization(SSH)and gene chip are two effective methods developed in recent years, which are used to screen all differential expression genes.However,SSH and gene chip have certain limitation respectively.It will be a perfect clone system when they are coupled with each other to exert their advantages and to make up their disadvantages.So in this article,the fundamentals,advantages and disadvantages of SSH and gene chip,the technique characteristic and the application of SSH coupled with gene chip to rapid identification differential expression genes in plant were reviewed.

Suppression subtractive hybridization(SSH);Gene chip;Differential expression genes;Application

10.3865/j.issn.1001-3547.2009.20.001

国家自然科学基金（30571262）；“十一五”国家科技支撑计划（2006BAD01A7）；西北农林科技大学“青年学术骨干支持计划”（01140304）；西北农林科技大学人才基金（01140508）

陈儒钢（1978-），男，博士，讲师，主要从事蔬菜育种与生物技术的研究。E-mail：rugangchen@126.com

巩振辉，通信作者，教授，博士生导师，主要从事蔬菜种质资源与育种及生物技术的研究。E-mail：gzhh168@yahoo.com.cn

2009-05-20