植物基因克隆技术的发展与展望

陈儒钢 巩振辉 逯明辉 李大伟 黄炜

（西北农林科技大学园艺学院，陕西杨凌，712100）

植物基因克隆技术的发展与展望

陈儒钢 巩振辉 逯明辉 李大伟 黄炜

（西北农林科技大学园艺学院，陕西杨凌，712100）

基因克隆技术是生命科学技术领域里非常重要的部分，为了纵览植物基因克隆的理论和技术的发展创新历程，对各种技术体系，正向遗传学途径、反向遗传学途径（包含定位克隆和同源序列克隆及随后发展起来的电子克隆）进行了综述。随着后基因组时代的到来，植物基因克隆技术将发挥更加重要的作用。

基因克隆 功能克隆 定位克隆 转座子标签法 抑制性差减杂交 同源序列法 基因芯片 电子克隆

植物基因的克隆技术是生命科学研究的重要组成部分，是现代生命科学技术中最核心的内容，它是随着20世纪70年代初DNA体外重组技术的发明而发展起来的，其目标是识别和分离特异基因并获得基因完整序列，确定其在染色体上的位置，阐明其生化功能，并利用生物工程手段应用到生产实践中去。一般来讲，基因克隆的策略可分为两种途径：正向遗传学途径和反向遗传学途径。正向遗传学途径以待克隆的基因所表现的功能为基础，通过鉴定基因的表达产物或表型性状进行克隆，如功能克隆和表型克隆等；反向遗传学途径则着眼于基因本身特定的序列或者在基因组中的特定位置进行克隆，如定位克隆、同源序列法克隆等；随着DNA测序技术和生物信息学的发展，又产生了电子克隆等新兴克隆技术。目前，在玉米，水稻、油菜、拟南芥、烟草、番茄等多种植物中，已经克隆了许许多多与植物的产量、品质、抗性及农艺性状等相关的基因。现对在植物基因克隆过程中运用的主要技术进行综述，以把握植物基因克隆技术的发展历程，并对未来的发展趋势进行展望。

1 功能克隆

功能克隆（Functional Cloning）就是从蛋白质的功能着手进行基因克隆，是人类采用的第一个克隆基因的策略。其基本内容为：根据已知的生化缺陷或特征确认与该功能有关的蛋白质，分离纯化蛋白并测定出部分氨基酸序列，根据遗传密码推测其可能的编码序列，设计相应的核苷酸探针，杂交筛选cDNA文库或基因组文库，或者使用该蛋白质特异的抗体，筛选表达载体构建的cDNA文库，通过抗原抗体反应寻找特异的克隆，最后对选中的克隆测序，获得目的基因的序列。用这一策略克隆基因的关键在于必须首先分离出一个纯的蛋白，测定出其一部分氨基酸序列或得到相应抗体；其次要构建cDNA文库或基因组文库；然后要对文库进行杂交筛选。Li L G等通过功能克隆的方法，从拟南芥中克隆到一个解毒外运载体蛋白基因并发现了一个包含至少56个编码相关蛋白基因的基因家族[1]。随着生命科学研究的深入，以及蛋白质双向电泳技术和蛋白质测序技术的日趋成熟与完善，各种差异表达的蛋白质将被大量分离纯化，必将给功能克隆提供更好的条件，使之得到更加广泛的应用，功能克隆将会继续发挥其重要作用。

2 定位克隆

定位克隆技术 （positional cloning）又叫图位克隆（map-based cloning），是根据目标基因在染色体上的位置进行基因克隆的一种方法，适合于克隆编码产物未知的基因。其基本原理是根据功能基因在基因组中存在相对较稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上，用与目标基因两侧紧密连锁的分子标记筛选含有大的插入片段的基因组文库（如BAC和YAC），用筛选到的阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群，再通过染色体步行（chromosome walking）逐步逼近候选区域或通过染色体登陆（chro-mosome landing）的方法获得含有目标基因的大片段克隆，将含有目标基因的大片段克隆进行亚克隆，或以大片段克隆作探针筛选cDNA文库；从而将目标基因确定在一个较小的DNA片段上并进行序列分析，通过遗传转化和功能互补试验分析，鉴定获得目的基因。

植物中运用图位克隆技术，从拟南芥、水稻、番茄、大麦、小麦、甜菜、马铃薯等植物中分离了几十个重要的基因，并以抗病基因的克隆居多，如番茄的基因[2]，基因[3]；马铃薯的基因[4]，拟南芥的基因[5]、基因[6]、基因[7]和水稻的等基因[8～10]。近年来中科院院士、华中农业大学教授张启发领导的“基因组研究与水稻遗传改良”国家创新团队利用图位克隆的方法相继分离克隆出同时控制水稻株高、抽穗期和每穗粒数的基因和控制水稻籼粳不育和广亲和性状的主效基因，以及调控水稻开花时间、影响其生长周期的基因，在水稻功能基因组研究领域取得重大突破[11～13]。定位克隆理论上适用于一切基因，但由于定位克隆依赖于高密度的分子标记连锁图谱，因此该技术对于基因组较小，重复序列少而且已经构建了高密度RFLP或RAPD等标记图谱的植物无疑是非常有效的，如拟南芥、水稻等模式植物。但对于小麦、玉米等基因组大而且重复序列多，又难于构建高密度分子标记连锁图的植物来说，要相对困难得多。对这类作物采用该方法分离克隆基因存在成本高、效率低、进展缓慢的缺点。但随着比较基因组研究的兴起，利用同科异种植物间染色体的共线性进行比较作图，如以拟南芥、番茄和水稻为中介来克隆其他十字花科、茄科和禾本科植物的基因，将成为一个新的发展方向。

3 转座子标签法（transposon tagging）

转座子（Transposon）是可从染色体的一个位置转移到另一位置的DNA片段，最早在玉米中发现的，随后的研究表明，在生物界中转座子是普遍存在的，并在生物的遗传进化方面有重要作用。转座子标签技术克隆基因的基本原理是，利用转座子插入到基因内部或邻近位点，会引起相关表型突变的特点，以转座子的已知序列为标签，克隆因转座子插入而功能失活的基因。如果某基因的突变是由于转座子插入而造成的，那么以转座子序列为探针就可从变异株的基因组中筛选出带有此转座子的部分基因，再以突变基因的部分序列作探针，即可从野生型文库中克隆出完整的基因。在植物中利用转座子的有玉米的Ac/Ds，En/Spm和金鱼草的Tn3等，其中应用最多的是Ac/Ds双因子系统。

利用转座子标记技术目前已克隆到的植物抗病基因有玉米抗圆斑病基因[14]，番茄抗叶霉病基因15-19]，烟草抗花叶病毒病基因[20]，亚麻抗锈病基因等[21～22]。该技术是目前分离克隆抗病基因有效工具之一。

随着农杆菌介导转座子导入目标植物系统建成后，目前已在拟南芥、番茄、水稻中有广泛的运用。同时，随着拟南芥、水稻等模式植物的基因组测序完成，研究的热点转向功能基因组，转座子标签技术己经成为构建植物突变体库，进行基因功能研究的核心技术。

4 抑制性差减杂交

抑制消减杂交技术（SSH）是1996年由Diatchenko L建立的以抑制性PCR为基础的DNA消减杂交方法[23]。其依据的技术主要有两点：①消减杂交；②抑制PCR。经抑制消减杂交后的cDNA群体不仅富集了差异表达基因（目的基因），而且目的基因间丰度的差异经过均等化作用已基本消除，使消减后的cDNA群体为丰度一致的目的基因群体。

与其他差异表达基因克隆技术相比，SSH技术具有明显的优越性：①假阳性率大大降低，这是它的最大优点。这是由它的两步消减杂交和两次抑制PCR所保证的。②高敏感性。在DDRT和cDNA-RDA中，低丰度的mRNA一般不易被检出，SSH方法所做的均等化和目标片段的富集，保证了低丰度mRNA也可能被检出。③速度快，效率高。一次SSH反应可以同时分离几十或成百个差异表达基因。另外，此技术还具有背景低、重复性好的特点。

SSH技术作为一种较为有效的分离差异表达基因的方法，已经被广泛用于豌豆对枯萎病的抗性机理研究[24]，马铃薯晚疫病抗病相关基因的分离研究[25]，大豆花叶病毒诱导特异表达基因的分离[26]，水稻幼穗发育早期特异表达基因的分离[27]，胡萝卜体细胞胚根发育相关基因的分离[28]，及玉米耐铝离子毒害基因的分离[29]等方面，显示了良好的应用前景。

SSH也有一定的缺点：①SSH技术需要几微克量的mRNA，如果量不够，那么低丰度的差异表达基因的cDNA很可能会检测不到，这是SSH技术不能被广泛应用的主要障碍。②SSH技术得到的cDNA是限制酶消化的cDNA，不再是全长cDNA，当然，这个缺陷可以通过筛选cDNA文库或者采用RACE的方法获得全长目的基因。③不能同时对数个材料进行比较，材料之间存在过多的差异及小片段缺失也不能被有效检测。

5 同源序列法

同源序列法是根据与待克隆基因同源的已知序列进行基因克隆的方法。目前很多植物基因序列已知，当要克隆类似基因时可先从Genbank库中找到有关基因序列，设计出特异引物；以植物基因组DNA或者cDNA为模板，采取PCR或RT-PCR的方法来扩增目的基因；扩增的片段经纯化后，连接到合适的载体上，进行序列分析、比较验证并确认目的基因的克隆。这是PCR技术诞生后出现的一种快速、简便克隆植物基因的方法。抗病基因同源序列法 （Resistance gene analogs，RGAs）也属于同源序列克隆的范围。尽管抗病基因的病原物种类不同，但这些抗病基因的产物（即在抗病反应中起重要作用的蛋白质）却存在着非常类似的结构域，如核苷酸结合位点（NBS)、富亮氨酸重复序列（LRR）、丝氨酸苏氨酸激酶（STK）、亮氨酸拉链结构（LZ）、跨膜结构域（TM）、TIR（白介素-1区域）等。利用这些保守结构域的特性，设计特异性的简并引物，以植物总DNA、cDNA为模板进行PCR扩增，就可得到抗病基因的候选片段，再通过分析验证、确认目的基因的克隆。王石平等根据这些保守序列设计合成了特异性和兼并性引物，对水稻基因组DNA进行扩增，得到了100个大小不同的克隆，定位了26个克隆，其中10个克隆与8个已定位的水稻抗病基因在分子标记连锁图上的位置对应或毗邻，这表明这些克隆的抗病基因在染色体位置上有较好的对应关系，证明了同源序列分离和克隆基因的可能性[30]。Chen R G等根据这些保守序列设计合成兼并性引物，对抗根结线虫辣椒DNA进行扩增，获得了25个抗病基因同源序列，聚类分析将其分为7个不同的类别。根据其中与番茄抗根结线虫基因同源性较高的RGA序列信息，克隆了辣椒抗根结线虫基因[31]。

6 基因芯片技术（gene chips）

基因芯片又称DNA芯片、DNA微阵列 （DNA microarray），是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测，从而迅速得出所要的信息。基因芯片具有高通量、高信息量、快速、并行检测、样品用量少、用途广泛等优点，已经被广泛应用到基因表达检测、突变检测、基因组多态性分析和基因文库作图以及杂交测序等方面。基因芯片根据功能可分为基因表达芯片（gene expression microarray）和DNA测序芯片 （DNA sequencing chip）2类；按基因芯片的用途可分为表达谱芯片、诊断芯片、指纹图谱芯片、测序芯片等；根据所用探针的类型可分为cDNA微阵列芯片和寡核苷酸阵列芯片。

李永春等为探讨小麦水分胁迫反应的分子调控机制，以抗旱小麦品种 “洛旱2号”根系为材料，采用Affymetrix小麦基因芯片比较了20%PEG6000溶液处理后根系及对照的基因表达谱，筛选到一批水分胁迫响应基因，涉及到生物代谢、逆境胁迫反应、细胞组分生成、蛋白合成、细胞信号交流、细胞运输、转录相关、细胞分裂和蛋白质加工等多个功能基因群，为克隆抗旱基因及开展抗旱分子育种提供了有用信息，也为进一步探讨小麦水分胁迫反应的分子调控机制积累了重要资料[32]。张晓婷等利用Affymetrix水稻全基因组芯片对水稻条纹病毒（Rice stripe virus，RSV）接种后出现条纹症状第7天的武育粳3号水稻病叶和相应的健康叶片进行了全基因组表达谱分析，得到3517个差异基因，其中2002个表达上调，1515个表达下调。根据TIGR数据库注释和MIPS基因功能分类标准将差异基因归类为15个功能类别，多数差异基因与植物防御、信号传导及蛋白质、碳水化合物的代谢相关，一些转录因子的表达也发生了明显的变化。代谢途径分析表明，RSV侵染后磷酸戊糖途径、类黄酮合成途径和芸薹素合成途径的相关基因表达明显增强，赤霉素合成途径相关基因的表达受到了抑制[33]。

基因芯片与传统的膜杂交相比有以下优点：①芯片点样密度远远高于膜的点样密度、样品用量少、信息量大。②芯片可用双色荧光标记两种探针，这样数据准确度大大提高；而膜通常用核素标记探针，一张膜只能杂交一种探针，数据可比性差；③芯片杂交体积小，灵敏度高；膜杂交体积大，灵敏度差；④芯片具有表面平整性好、硬度大、透明等特点，比易卷曲的膜杂交更容易在点样、杂交、图像处理及数据采集等方面自动化。基因芯片具有高通量、高信息量、快速、样品用量少、造价低、用途广泛等优点。

7 电子克隆（electronic cloning）

电子克隆，又称计算机杂交 （computer hybridization），是以数学算法为手段，以计算机和互联网为工具，利用现有的基因序列、表达序列标签（EST）、蛋白序列和生物信息数据库，发掘新基因，并通过生物学试验进行编码序列和功能验证而克隆基因的方法。电子克隆的理论基础是利用绝大部分功能基因的编码区比较保守，同源性较高的特点，采用生物信息学的手段，通过同源性分析延伸EST序列，以获得基因潜在的部分乃至全长的cDNA序列。

电子克隆基因的基本过程：第一步，以感兴趣的基因或同源基因的EST为查询序列，用BLASTN检索对应的EST数据库，检出与起始查询序列有同源性或有部分重叠的EST序列，长度＞100 bp，同源性50%～85%。第二步，将检出序列组装为重叠群（contig），以此重叠群为被检序列，重复进行BLAST检索与序列组装，延伸重叠群系列，重复以上过程，直至没有更多的重叠EST检出或者说重叠群序列不能继续延伸，获得基因的候选cDNA序列。第三步，将获得的候选cDNA序列与GeneBank核酸数据库进行相似性检测。假如没有精确匹配基因，将EST序列数据按EST六种阅读框翻译成蛋白质，接着与蛋白质序列数据库进行比较分析。基因分折的结果大致有3种：第一是已知基因，是研究人类已鉴定和了解的基因；第二是以前未经鉴定的新基因；第三是未知基因，这部分基因之间无同种或异种基因的匹配。第四步，对新基因和未知基因进行生物学研究，可以根据获得的基因的候选序列设计引物，用基因组PCR或者RT-PCR的方法获得基因的基因组序列或者cDNA序列，再进一步进行功能验证。在电子克隆的基础上，也可通过IMAGE协议索取相应的免费克隆，以避免筛选全长基因的麻烦，以集中精力进行基因功能研究。

电子克隆充分利用已有的生物信息资源，从ESTs序列入手、通过同源筛选，获得基因部分乃至全长cDNA序列，避免或减轻了构建与筛选cDNA文库等繁重、耗时的实验室工作，将大大加快基因克隆的方法。与传统的实验室克隆基因的繁杂、耗时、费用高、效率不高的方法相比，电子克隆更为简捷、快速、费用大大降低。随着多种模式生物的基因组测序工作的完成，以及各种生物的EST数据库的建立和充实，电子克隆必将在基因克隆的领域占有重要的一席之地，也必将加快新基因的发现与克隆的进程。

8 趋势与展望

生物的基因是一片海洋，在基因克隆的领域，人类已经迈出了坚实的步伐，但要彻底破译生命的天书，基因克隆的研究仍任重而道远，基因克隆的进展依赖于基因克隆技术的发展与创新。展望未来，基因克隆技术的发展将可能有以下趋势。

①高通量，高效率，经济快速的基因克隆技术将会领导潮流，如SSH、基因芯片等。生命科学的发展一日千里，效率低下、耗时耗力的克隆技术必将退出舞台。

②全基因组测序将成为一种趋势。植物中，随着拟南芥、水稻基因组测序的完成，必将会有更多的植物进行全基因组测序，如玉米、柑桔等就是重要的候选对象。

③探讨众多功能基因之间的调控网络将成为今后的研究重点。当前飞速发展和不断完善的高通量基因克隆技术，如基因芯片技术，能够在短时间内获得大量的基因组表达谱数据，可以定量地、从整体上对植物功能基因的作用机理进行深入的研究，从而把对功能基因调控作用的认识从单个基因水平上升到众多基因的网络层次，整合相关研究的信息以全面认识功能基因的调控网络，有助于从多维度系统水平上为利用功能基因进行植物基因工程改良提供理论依据。

④在基因克隆中，计算机技术、电子技术将扮演更加重要的角色。基因组测序，基因芯片，电子克隆等技术的产生与发展，都与计算机技术的发展息息相关。面对日益增多的生物信息的海洋，没有计算机技术和电子技术的辅助，人类只能望洋兴叹。

⑤不同的基因克隆技术之间的相互交叉融合。例如抑制消减杂交与基因芯片技术相结合，电子克隆与RT-PCR相结合等，将显示出巨大的应用前景。

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Development and Prospect of the Gene Cloning Technology in Plant

CHEN Rugang,GONG Zhenhui,LU Minghui,LI Dawei,HUANG Wei

Gene cloning technology is a very important in life science area.In order to insight the development and renovation process of gene cloning theories and techniques,many important cloning technique system applied in plant research were reviewed.Forward genetics strategy was based on expressed functions of genes,which by means of identifying the product or the mutant phenotype of gene.Forward genetics strategy included two aspects:functional cloning and phenotype cloning.Reverse genetics strategy was founded on the special location and sequences of gene itself,including positional cloning,homology cloning,and electronic cloning which developed in recent years.With the advent of post-genome era,plant gene cloning technology will play more important role in the future.

Gene cloning;Functional cloning;Positional cloning;Transposon tagging;Suppression subtractive hybridization;Homology cloning;Gene chips;Electronic cloning

10.3865/j.issn.1001-3547.2009.20.004

国家自然科学基金（30571262）；“十一五”国家科技支撑计划（2006BAD01A7）；西北农林科技大学“青年学术骨干支持计划”（01140304）；西北农林科技大学人才基金（01140508）

陈儒钢（1978-），男，博士，讲师，主要从事蔬菜育种与生物技术的研究。E-mail：rugangchen@126.com

巩振辉，通信作者，博士生导师，主要从事蔬菜种质资源与育种及生物技术的研究。E-mail：gzhh168@yahoo.com.cn

2009-06-02