组织工程医疗产品免疫学评价研究

陈 亮 奚廷斐 王春仁

组织工程医疗产品免疫学评价研究

陈 亮 奚廷斐 王春仁

组织工程是一门将生命科学和工程学的原理与技术相结合，发展具有生物活性功能的替代物或移植物，用于修复、改善、再生组织和器官的结构和功能的交叉学科。组织工程医疗产品（Tissue Engineered Medical Products,TEMPs）是用组织工程技术和工艺制备的，含有经生产工艺处理的人体细胞和组织，用于再生、修复或替代人体组织的医用产品。

组织工程医疗产品可包括细胞、生物材料（基质或支架）、生物分子等，是复杂的联合产品，其产品的风险分析和安全性评价也具有复杂性。在组织工程中得到广泛应用的生物材料，包括聚乳酸、聚羟基烷基酸酯等聚酯类可降解高分子材料，还有胶原及细胞外基质等生物组织衍生材料，以及壳聚糖、海藻酸钠等天然生物材料。这几类生物材料单独植入后的异物炎症反应是目前局部反应评价试验的主要内容，但近来已有研究表明这几类植入生物材料可影响免疫系统。另外，TEMPs除含有生物材料外，不同来源的细胞也是重要的组成成分。为达成商品化，同种异体来源的细胞（体细胞或干细胞）是现实的选择。因此，从理论上分析，组织细胞中含有的过客抗原呈递细胞、异体细胞分泌物、死细胞或碎片都将引起免疫应答反应，从而影响TEMPs的活性和功能。由于TEMPs中生物材料和同种异体细胞的同时存在，也将植入后宿主反应演化为异物炎症反应和免疫反应，而两者间还存在相互作用。因此，对植入后宿主反应的评价，特别是免疫学评价就成了组织工程医疗产品风险分析和安全性评价新的课题。

免疫学评价是检测对免疫系统结构和功能的不良影响，或由对其他系统的影响而导致的免疫功能障碍。当抵抗感染或肿瘤等疾病的体液免疫或细胞免疫受到损害（即免疫抑制），或出现不必要的组织损伤（如自身免疫、超敏反应或慢性炎症）时，即认为发生了免疫毒性作用。对免疫功能的影响还表现为免疫刺激，即非目的性的或不恰当的免疫系统的激活（抗原特异性或非特异性），包括生物材料非目的性的免疫原性（如异体蛋白的抗原或细胞免疫反应）和佐剂效应（即材料加强了与其共同存在的抗原的免疫反应）。目前对TEMPs中的生物材料（胶原、细胞外基质、聚合物、海藻酸钠）成分和间充质干细胞成分的免疫学评价方面的研究结果如下文所述。

1 胶原

胶原（主要是Ⅰ型胶原）是大量存在于多种生物体组织的结构和功能蛋白，虽然已被广泛认为是一种安全有效的生物材料，但动物来源的胶原总是会引起对其可能会引发免疫反应的关注[1]。胶原的抗原决定簇可分为三类：胶原分子三螺旋结构构象本身、胶原螺旋结构中的氨基酸序列和胶原非螺旋末端肽段。虽然胶原非螺旋末端的氨基酸在种间的变异可达到50%以上，在一些供者/受者组合的动物试验（牛/兔、大鼠/兔）中发现主要的抗原决定簇位于这些区域，但是在其他不同的供者/受者组合的动物试验中发现主要抗原决定簇在于三螺旋结构构象本身（牛/大鼠、牛/小鼠）或是螺旋结构中的氨基酸序列（大鼠/鸡），由此说明胶原分子主要抗原决定簇的定位取决于供者和受者的种间组合[1]。研究表明，胶原在人体使用后，牛胶原（ZyDerm，酶解制备）的抗原决定簇位于三螺旋结构和氨基酸序列[2]。因此，动物来源的胶原，即使是通过酶解去除了高度变化的末端肽段的胶原，也应详细研究在人体引起的免疫反应。

胶原引起的免疫反应包括体液免疫和细胞免疫，但两者相对作用还未阐明。研究发现，胶原引起免疫反应同样取决于供者和受者的种间组合。临床通过检测循环抗体的水平来评估胶原免疫反应风险[3]。目前研究最充分的胶原产品可能是注射型胶原充填剂，相关资料表明人群中对牛胶原的超敏反应发生率为2%～4%，使用胶原产品后会增加1%左右，不良反应发生率较低[4-5]。但是，新的胶原材料，以及新的应用方式不断增加，例如作为皮肤替代物、骨填充物、心血管支架材料、止血材料等。已有报道在这些应用中出现了稍微增高的变态反应发生率[6]和肉芽肿异物反应[7]。用牛Ⅰ型胶原密封的多孔聚酯血管在猪体内植入后，观察期内胶原抗体阳性率为41%～68%，引起了对胶原引发体液免疫反应和植入局部炎症反应间关联性的关注[8]。因此，以胶原为支架材料与同种异体细胞复合，对此应用中的胶原进行免疫学及其引发免疫反应在整个胶原-细胞复合物引起宿主反应中的作用的评价是亟待解决的问题。

2 细胞外基质

细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）也是在组织工程中广泛应用的生物支架材料，如经处理的猪小肠粘膜下层(Small Intestinal Submucosa，SIS)、膀胱粘膜下层、人羊膜等。ECM除主要由胶原构成外，还含有其他抗原性蛋白，而且取决于脱细胞处理方法，残留的细胞成分也决定着免疫反应的发生。因为，完全除去细胞膜及细胞核物质是困难的，或是不可能的[9]。以非交联SIS（无细胞的）进行的动物试验中出现了Th2型免疫反应，再次植入增强了Th2型反应，但未出现致敏[10]。研究表明，猪SIS含有少量半乳糖（α-gal）抗原决定簇，虽然半乳糖决定簇的含量和分布，或产生的抗体未导致补体活化[11]，SIS在人体应用后也未检测到抗半乳糖抗体增加[9]，但也反应了这类细胞外基质材料具有免疫原性的现实。非交联SIS降解代谢迅速（单层约90%在28 d降解，多层在90～120 d完全降解），也许是SIS未引起排斥性反应的原因。而低剂量半乳糖决定簇的持续存在是异种移植慢性排斥的原因[12]，降解缓慢或经交联处理的细胞外基质材料可能会存在这样的问题，已有报道显示光氧化交联的心包组织引起的抗体反应长达2年[13]。组织工程构建的组织器官的多样化，决定了用于不同目的的细胞外基质具有不同性质，包括降解性能和是否需要交联加强力学强度等，也决定了免疫学评价的必要性。而且，上述SIS试验结果是发生在SIS无细胞前提下，组织工程中的细胞外基质复合细胞的免疫学评价研究尚未深入开展。

3 聚合物

在组织工程中应用较多的可降解聚合物包括聚乳酸、聚乙醇酸、聚羟基烷基酸酯等。一般评价其植入后的生物相容性是基于发生的异物炎症反应的程度，即组织反应的纤维化和血管化的程度，目前认为这些材料植入后局部反应是可接受的。但新的研究表明，这类聚合物材料对机体免疫系统也有影响。很直接的证据来自疫苗方面的研究，利用聚乳酸或聚乳酸-聚乙醇酸（PLGA）制成可降解微球，包被抗原性蛋白，可以作为单次性疫苗而产生免疫作用[14]，聚合物是作为免疫佐剂发挥作用，抗原的聚合物微球形式促进了抗原呈递细胞对其的吞噬，增强了巨噬细胞和树突状细胞的活化[15]。但是，在组织工程领域，TEMPs应避免刺激免疫系统以避免排斥和免疫炎症反应，聚合物材料的免疫佐剂效应可能是不需要的副作用。已有研究表明这样的免疫佐剂效应在聚乳酸作为生物支架材料时也可能发生，模式抗原蛋白与聚乳酸多孔支架共同植入后，引起的抗体反应虽与完全弗氏免疫佐剂有差异，但也显著高于单纯的抗原蛋白注射，且与聚乳酸微球效应相似[16]。进一步研究显示，PLGA可以促进单核细胞来源的树突状细胞成熟[17]，该作用与PLGA形状有关，免疫佐剂作用的进一步机理还有待研究。甲基丙烯酸-2-羟基乙酯的免疫佐剂效应也有报道[18]，在动物试验中引起了对内源性蛋白的自身抗体。另外，聚合物的抗原性也被证实，动物试验中检测出了抗聚酯Dacron的抗体[19]。因此，在聚合物作为TEMPs的支架材料时，对其免疫学评价应成为TEMPs安全性和有效性的研究内容。

4 天然生物材料

壳聚糖是自甲壳纲动物的甲壳中提取的聚糖，或是在一些酵母菌和霉菌中合成，通过发酵得到。壳聚糖作为生物材料得到了广泛应用，它具有良好的生物活性，并可制成膜、海绵状、微粒、凝胶等。研究也显示壳聚糖具有免疫刺激活性[20]，能活化非特性免疫系统的成分，如巨噬细胞等。在疫苗中也用作佐剂去增强免疫[21]。研究已发现针对几丁质产生的抗体，虽然报道在植入后未检测到针对壳聚糖的抗体[22]，但壳聚糖是否存在抗原性还需进一步证明。

海藻酸钠是1，4-糖苷键连接的β-D-甘露糖醛酸和α-L-古罗糖醛酸构成的共聚物，也是应用广泛的天然生物材料，多从褐藻中提取，也可通过细菌发酵生产。研究报道海藻酸盐微囊在疫苗配方中可发挥佐剂作用。由甘露糖醛酸含量高的海藻酸钠植入小鼠后检测到了海藻酸钠抗体的产生[23]。而由海藻酸钠衍生的低聚糖—寡聚甘露糖醛酸酯（Oligomannuronate）对活化的免疫细胞反应性氧化物的产生有抑制作用[24]。这些结果表明了对免疫系统可能存在的影响。

海藻酸钠微囊作为异种或异体细胞的免疫隔离包囊是组织工程中一类重要方法。在这样的应用中，微囊发挥的细胞隔离效果、微囊的分子量截断产生的阻滞效应、微囊植入产生的炎症反应都是决定微囊化细胞是否发挥作用时值得评价的免疫学方面的影响因素。

5 细胞

组织工程中的细胞来源理论上包括异种、异体及自体细胞（体细胞或干细胞），本文的讨论集中在同种异体间充质干细胞上。间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSC）主要存在于骨髓，但也可从脐带血、脂肪或其他组织分离获得。研究报道狒狒MSC不会引起同种异体淋巴细胞的增殖[25]，人MSC在混合淋巴细胞反应中可抑制T淋巴细胞的增殖[26]，抑制程度与MSC的数量具有量效关系[27]。另一方面，也有试验报道发现了主要Ⅱ类组织相容性抗原复合体(Major Histocompatibility Complex，MHC)在人MSC的较强表达，在单向混合淋巴培养试验中，经γ射线照射或多聚甲醛处理的MSC可以促进同种异体T淋巴细胞的增殖[28]；但在单向混合淋巴细胞培养试验中，MSC作为第三方细胞却可以抑制淋巴细胞的增殖，并表现出了否定样（Veto-like）细胞的功能[28]，即对同种异体抗原引起的细胞毒性作用有抑制效果，而对记忆抗原(Recall antigen)引起的免疫反应无影响，这种区别反应能力对MSC的临床应用是有帮助的。不过，有报道在同种异体的小鼠肿瘤移植试验中发现MSC具有的免疫抑制作用有利于肿瘤生长[29]。

此外，研究报道MSC可抑制单核细胞来源的树突状细胞的分化和功能[30]；在一定条件下抑制自然杀伤细胞的增殖、细胞因子分泌，以及对HLA-Ⅰ类抗原的细胞毒性作用等，但活化的自然杀伤细胞能破坏MSC[31]。

6 组织工程医疗产品

生物材料支架和细胞构成的组织工程医疗产品在植入后的宿主反应包括对生物材料的（异物）炎症反应和对细胞的免疫反应[32]，而且对于以上所提及的胶原、细胞外基质、聚乳酸、壳聚糖、海藻酸钠等，还要包括生物材料本身即具有抗原性或免疫原性，或对免疫系统的影响作用。对生物材料的炎症反应和对细胞的免疫反应将是相互影响的过程。生物材料引起炎症反应将具有佐剂效果，巨噬细胞等抗原呈递细胞将局部出现，因与生物材料接触或吞噬生物材料降解产物而活化。炎症反应结果是巨噬细胞、白细胞活化，释放细胞因子、生长因子、蛋白溶酶、活性氧类和活性氮类等，而调节炎症反应的免疫细胞因子将是炎症反应和免疫反应相互影响的环节之一。巨噬细胞等被激活后可分泌细胞因子如IL-1、IL-6、IL-12、IL-18和TNF-α、IFNγ等，可促进T细胞增殖，增强细胞毒性，从而可影响植入的MSC的存活和功能。并且这些细胞因子也可直接作用于MSC，如IFNγ可以诱导MSC表达MHCⅡ类抗原[33]。

每一种组织工程医疗产品都具有独特性,其特有的生物材料支架和细胞的组合，其引起的炎症反应和免疫反应，以及两者的相互作用也将是不同和各具特点的，对其的评价将成为对其安全性和有效性评价中不可缺少的一环。

[1]Lynn AK,Yannas IV,Bonfield W.Antigenicity and immunogenicity of collagen[J].J Biomed Mater Res B Appl Biomater,2004,71(2): 343-354.

[2]Ellingsworth LR,DeLustro F,Brennan JE,et al.The human immune response to reconstituted bovine collagen[J].J Immunol,1986,136 (3):877-882.

[3]Elson ML.The role of skin testing in the use of collagen injectable materials[J].J Dermatol Surg Oncol,1989,15(3):301-303.

[4]Cooperman L,Michaeli D.The immunogenicity of injectable collagenⅡ.A retrospective review of seventy-two tested and treated patients [J].J Am Acad Dermatol,1984,10(4):647-651.

[5]Charriere G,Bejot M,Schnitzler L,et al.Reactions to a bovine collagen implant.Clinical and immunologic study in 705 patients [J].J Am Acad Dermatol,1989,21(6):1203-1208.

[6]Nelson PA,Powers JN,Estridge TD,et al.Serological analysis of patients treated with a new surgical hemostat containing bovine proteins and autologous plasma[J].J Biomed Mater Res,2001,58 (6):710-719.

[7]McGregor DH,MacArthur RI,Carter T.Avitene granulomas of colonic serosa[J].Ann Clin Lab Sci,1986,16(4):296-302.

[8]Schlosser M,Zippel R,Hoene A,et al.Antibody response to collagen after functional implantation of different polyester vascular prostheses in pigs[J].J Biomed Mater Res A,2005,72(3):317-325.

[9]Badylak SF.Xenogeneic extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction[J].Transpl Immunol,2004,12(3-4):367-377.

[10]Allman AJ,McPherson TB,Badylak SF,et al.Xenogeneic extracellular matrix grafts elicit a TH2-restricted immune response[J]. Transplantation,2001,71(11):1631-1640.

[11]McPherson TB,Liang H,Record RD,et al.Galalpha(1,3)Gal epitope in porcine small intestinal submucosa[J].Tissue Eng,2000,6(3): 233-239.

[12]Schussler O,Shen M,Shen L,et al.Effect of human immunoglobulins on the immunogenicity of porcine bioprostheses[J].Ann Thorac Surg,2001,71(5 Suppl):S396-400.

[13]Moore MA,Phillips RE.Biocompatibility and immunologic properties of pericardial tissue stabilized by dye-mediated photooxidation[J]. J Heart Valve Dis,1997,6(3):307-315.

[14]Stivaktakis N,Nikou K,et al.PLA and PLGA microspheres of βgalactosidase:effect of formulation factors on protein antigenicity and immunogenicity[J].J Biomed Mater Res A,2004,70(1):139-148.

[15]Igartua M,Hernandez RM,Esquisabel A,et al.Enhanced immune response after subcutaneous and oral immunization with biodegradable PLGA microspheres[J].J Control Release,1998,56(1-3):63-73.

[16]Matzelle MM,Babensee JE.Humoral immune responses to model antigen co-delivered with biomaterials used in tissue engineering [J].Biomaterials,2004,25(2):295-304.

[17]Babensee JE,Paranjpe A.Differential levels of dendritic cell maturation on different biomaterials used in combination products [J].J Biomed Mater Res A,2005,74(4):503-510.

[18]Sandberg E,Bergenholtz G,Eklund C,et al.HEMA bound to self-protein promotes auto-antibody production in mice[J].J Dent Res,2002,81(9):633-636.

[19]Zippel R,Wilhelm L,Marusch F,et al.Antigenicity of polyester (Dacron)vascular prostheses in an animal model[J].Eur J Vasc Endovasc Surg,2001,21(3):202-207.

[20]Otterlei M,Varum KM,Ryan L,et al.Characterization of binding and TNF-alpha-inducing ability of chitosans on monocytes:the involvement of CD14[J].Vaccine,1994,12(9):825-832.

[21]Seferian PG,Martinez ML.Immune stimulating activity of two new chitosan containing adjuvant formulations[J].Vaccine,2000,19 (6):661-668.

[22]VandeVord PJ,Matthew HW,DeSilva SP,et al.Evaluation of the biocompatibility of a chitosan scaffold in mice[J].J Biomed Mater Res,2002,59(3):585-590.

[23]Kulseng B,Skjak-Braek G,Ryan L,et al.Transplantation of alginate microcapsules:generation of antibodies against alginates and encapsulated porcine islet-like cell clusters[J].Transplantation, 1999,67(7):978-984.

[24]Bland EJ,et al.The influence of small oligosaccharides on the immune system[J].Carbohydr Res,2004,339(10):1673-1678.

[25]Bartholomew A,Sturgeon C,Siatskas M,et al.Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo[J].Exp Hematol,2002,30(1):42-48.

[26]Di Nicola M,Carlo-Stella C,Magni M,et al.Human bone marrow stromal cells suppress T-lymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli[J].Blood,2002,99(10):3838-3843.

[27]Le Blanc K,Tammik L,Sundberg B,et al.Mesenchymal stem cells inhibit and stimulate mixed lymphocyte cultures and mitogenic responses independently of the major histocompatibility complex [J].Scand J Immunol,2003,57(1):11-20.

[28]Potian JA,et al.Veto-like activity of mesenchymal stem cells: functional discrimination between cellular responses to alloantigens and recall antigens[J].J Immunol,2003,171(7):3426-3434.

[29]Djouad F,Plence P,Bony C,et al.Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cells favors tumor growth in allogeneic animals [J].Blood,2003,102(10):3837-3844.

[30]Aggarwal S,Pittenger MF.Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses[J].Blood,2005,105(4):1815-1822.

[31]Sotiropoulou PA,Perez SA,Gritzapis AD,et al.Interactions between human mesenchymal stem cells and natural killer cells[J].Stem Cells,2006,24(1):74-85.

[32]Mikos AG,McIntire LV,Anderson JM,et al.Host response to tissue engineered devices[J].Adv Drug Deliv Rev,1998,33(1-2):111-139.

[33]Majumdar MK,Keane-Moore M,Buyaner D,et al.Characterization and functionality of cell surface molecules on human mesenchymal stem cells[J].J Biomed Sci,2003,10(2):228-241.

R392.9

B

1673－0364（2009）－01－0056－02

2008年6月20日；

2008年8月16日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.01.017

国家自然科学基金（30670573）。

100050北京市中国药品生物制品检定所。