组织工程膀胱的血管化及其策略

杨 斌 戴玉田 孙则禹

组织工程膀胱的血管化及其策略

杨 斌 戴玉田 孙则禹

一些先天性的疾病（如膀胱外翻）或炎症、感染、肿瘤以及创伤等可引起膀胱结构和功能的缺失或损害，常常需要一定的组织或材料进行膀胱的修复和重建[1]。在探索膀胱修复和重建的历史上，筋膜、膀胱粘膜下层、大网膜、小肠粘膜下层、合成材料等都由于生物相容性、机械力学性能以及植入物萎缩、纤维化、结石形成等并发症而宣告失败。迄今为止，利用肠道进行膀胱的修复和重建仍是进行膀胱替代的金标准[2]。但是，由于肠道处在泌尿系的环境中，可能会引起代谢紊乱、感染、结石形成甚至恶变等一系列并发症[3-4]。因此，探寻合理的膀胱替代物是医学界的一项挑战，而组织工程技术提供了新的思路和方法[2，5]。

1 组织工程膀胱研究的基本原理

组织工程膀胱研究的基本思路是，在体外大规模扩增膀胱种子细胞，再将其种植到支架材料上，在体外构建组织工程膀胱壁，然后植入体内以进行膀胱修复和重建。组织工程膀胱构建需要具备3个要素：支架材料，种子细胞和植入体内后建立血液循环以供给细胞生长、发育所需的物质并带走代谢产物。支架材料要求具有良好生物相容性、生物可降解性，并支持种子细胞黏附、生长以及发育等[6]。种子细胞主要是尿路上皮细胞和平滑肌细胞。研究显示，尿路上皮细胞再生能力较强，而平滑肌细胞再生能力则较差[7]。因此，组织工程膀胱构建的关键在于构建结构和功能良好的平滑肌组织。

2 血管新生和血管发生的机制

新生血管形成（Neovasculogenesis）包括血管发生（Vasculogenesis）和血管新生（Angiogenesis）。血管发生是指内皮细胞的前体细胞即内皮祖细胞（Endothelial progenitor cell）在血管生长的原位增殖、迁移、分化为成熟的内皮细胞并形成血管的过程。血管新生是指在已经存在的血管上以出芽方式形成新的血管的过程，即通过成熟内皮细胞迁移、增殖来形成新的血管[8]。以往认为，血管新生是出生后血管生长的唯一机制，但随着近年来外周血中发现内皮祖细胞，认识到血管发生不仅存在于胚胎时期，也是出生后新生血管形成的机制之一[9]。新生血管形成是血管内皮细胞、内皮祖细胞、促血管生成的因子、细胞外基质等相互作用，共同完成的一系列过程。

新生血管形成参与了重要的生理过程，如在创伤愈合和组织修复中，新生血管形成后，为病损区域供给营养物质，支持组织再生[10]。近年来，新生血管形成在治疗缺血性疾病的研究和应用中发挥了巨大的作用。研究发现，治疗性血管新生/血管发生能够明显改善心肌梗死和糖尿病肢体缺血患者缺血区的血液循环，改善组织和器官的功能[11-12]。利用新生血管形成的原理进行组织工程领域的人工组织血管化的研究也取得了极大进展[13]。

3 组织工程血管化研究的模型

组织工程血管化研究的模型主要有体外模型和体内模型。体外模型主要将组织工程组织在体外进行预血管化，研究内皮细胞参与预血管化的效应和各种生长因子的调节作用，揭示其中的分子机制[14]。体内模型主要研究植入组织在体内的血管化过程及其机制，主要包括植入物与宿主的相互作用、促血管化效应和生长因子的调节作用，常见的体内模型有角膜小袋模型、鸡胚绒毛膜尿囊模型、基质胶体内填塞模型、海绵基质体内植入模型以及肠系膜血管新生模型和小鼠背部皮下室模型[15]。2005年，Levenberg等[16]分别在体外模型和体内模型进行了骨骼肌组织的血管化研究。研究中将人脐带静脉内皮细胞、鼠成肌细胞种植于体外合成的三维多孔支架材料上，体外培养后进行组织学观察，发现有微血管网络形成，在培养基中加入VEGF、PDGF-BB及鼠成纤维细胞进行共培养，能增强体外预血管化效应。在体内模型中，将这种体外预血管化的肌组织种植入免疫缺失的大鼠背部皮下，发现体外形成的微血管网络与宿主的微血管建立吻合，形成有循环功能的血管系统，供应肌组织的营养物质。

4 组织工程膀胱血管化的策略

在体外，接种到支架材料上用于构建组织工程膀胱的种子细胞能够从培养基中获取营养；而植入体内早期，植入组织仅能依靠周围（100-200 μm的距离范围内）血液的扩散效应而获得代谢所需的物质，另外，宿主自身血管向植入组织长入的过程是极其缓慢且作用十分有限[13，17-18]。大面积的较厚的平滑肌组织，则会由于缺血、缺氧导致细胞凋亡或死亡，最终会影响平滑肌的发育并导致替代组织的功能障碍。因此，促进体外构建的膀胱组织植入体内后的快速血管化是目前组织工程膀胱面临的主要问题[19]。近年来，众多学者在该领域进行了积极探索，也取得了一定的进展。

4.1 支架材料的优化设计：血管化的先决条件

组织工程膀胱血管化的研究和应用首先需要选择合适的支架材料，影响组织血管化的支架材料的参数有支架材料的成分、表面特征、孔径、和孔隙率[6，20]。因此，对支架材料进行优化设计，能为促进组织工程膀胱的血管化提供先决条件。研究表明，在PGA中加入胶原成分能够明显促进组织工程膀胱在扩大成形术后的功能恢复，这可能是因为支架材料中的胶原成分促进了组织工程膀胱的血管化，快速地建立了血液循环[2]。还有研究显示，对PLGA的表面结构进行纳米修饰后能够明显增加内皮细胞和膀胱平滑肌细胞的密度[21－22]；进一步研究表明，该支架材料能够明显增强膀胱平滑肌细胞的黏附、增殖，促进弹力蛋白、胶原等细胞外基质的产生，增强膀胱平滑肌细胞的功能[23-24]。支架材料的孔径越大，孔隙率越高，血管化则越充分。因此，在制备无细胞基质作为支架材料时，增大孔径，提高孔隙率，可能会促进组织工程膀胱的血管化[25]。

4.2 复合生长因子：促进组织工程膀胱血管化

利用促进血管新生的生长因子（如VEGF，bFGF，PDGF家族等）能促使宿主自身血管快速长入植入组织，为组织工程膀胱体内充分快速血管化提供了另一种选择。生长因子通过促进内皮细胞迁移、增殖而促进血管新生，还可能通过动员宿主内皮祖细胞而发挥作用[26]。

有两种方法可以将生长因子复合到组织工程膀胱，生长因子基因转染技术是促使植入组织局部生长因子高浓度表达的手段之一，利用基因转染技术可以实现植入部位VEGF、PDGF-BB等生长因子的高表达，并促进血管新生和组织再生[27－28]。国内也有学者利用VEGF基因转染膀胱平滑肌细胞，使VEGF在局部高效表达而促进组织工程膀胱快速血管化；还有学者利用VEGF基因转染膀胱尿路上皮细胞，以促进组织工程尿道的血管化[29]。然而，基因水平上对蛋白表达的调控难以掌控，生长因子持续的过量表达可能会导致严重的不良反应。组织工程膀胱植入体内后，只需要生长因子在短期内的局部高表达，在血液循环建立后，则不再需要生长因子持续的高表达。因此，在植入组织局部直接包埋生长因子蛋白并使其持续释放，是促进组织工程膀胱快速血管化的最佳选择，这种方案给予宿主的是生长因子蛋白，比转染生长因子基因更安全[18]。近年的研究发现，将膀胱无细胞基质（BAM）在体外与bFGF、PDGF-BB、VEGF等生长因子孵育后，生长因子能够复合到脱细胞基质支架中，再将该支架材料植入小鼠体内，脱细胞基质中的胶原成分能保护生长因子免受体内蛋白水解酶的降解。随着支架材料的降解，生长因子能持续释放达2周[30]。研究发现，利用BAM体外复合VEGF、bFGF后再行膀胱替代，能促进替代组织的血管新生，并促进平滑肌组织的生长和发育，改善膀胱功能[31－32]。

4.3 接种血管内皮细胞：提供血管壁细胞成分

促进组织工程膀胱快速血管化的另一方法，就是利用内皮细胞将构建的组织工程膀胱进行预血管化，在植入体内后使其与宿主本身血管吻合，从而迅速建立血液循环[17]。利用内皮细胞进行组织工程膀胱预血管化涉及到内皮细胞的来源、内皮细胞和支架材料的相互作用、内皮细胞和种子细胞的联合培养、血管的发育成熟以及预血管化中的各种调节因素等复杂问题。

研究证实，将内皮细胞与平滑肌细胞体外共培养时，平滑肌细胞的VEGF、PDGF-AA、PDGF-BB和TGF-β的mRNA表达水平明显升高，bFGF及其受体的mRNA表达水平降低；PDGF-BB和TGF-β蛋白水平明显升高；内皮细胞VEGF mRNA和蛋白表达水平也升高。该研究提示我们，将内皮细胞和平滑肌细胞进行共培养时能促进相关生长因子的表达[33]。内皮细胞和平滑肌细胞共培养时所表达的PDGF-BB、TGF-β等生长因子还通过介导平滑肌细胞和内皮细胞的相互作用，促进新生血管稳定，发育成熟[10，34]。因此，利用内皮细胞和膀胱平滑肌细胞共培养，不仅可以对肌组织进行预血管化，而且还能够促进新生血管的发育与成熟[35]。

内皮细胞的来源大致可以分为两类，一类是成熟的内皮细胞，如脐静脉内皮细胞、成人外周血管内皮细胞。脐静脉内皮细胞来源广、易培养、增殖能力强。Levenberg等[16]利用脐静脉内皮细胞对组织工程构建的肌组织进行预血管化。但是，成熟内皮细胞也存在不足之处，脐静脉内皮细胞还存在异种或同种异体移植时的免疫排斥反应，成人外周血管的内皮细胞取材较困难，增殖能力欠佳[36]。

另一类是内皮细胞的前体细胞，即内皮祖细胞。血管内皮祖细胞被认为是血管内皮细胞的前体细胞，在功能和形态方面不同于成熟内皮细胞。体内和体外实验证实：内皮祖细胞能够分化为内皮细胞，并具有很强的增殖潜能，同时还分泌促进血管新生的生长因子，能够促进新生血管的形成，这被认为是出生后“从无到有”的新生血管形成过程。内皮祖细胞在治疗性血管新生领域已经显示出极大的研究和临床应用价值，能够明显促进糖尿病所致的肢体缺血区和心肌梗死区的新生血管形成，改善缺血区的血液供应和组织、器官的功能[9，11，36]。国内已有学者将内皮祖细胞用于组织工程皮肤血管化的研究[37]。另外，内皮祖细胞不仅存在于脐带血，还存在于骨髓和外周血，这为利用自体的内皮祖细胞进行组织工程膀胱的血管化提供了可能，并且能够避免免疫排斥反应。

4.4 制备带血管蒂的无细胞基质支架

带血管蒂的移植物在修复重建的治疗中已经被广泛应用。Schultheiss等[38]将带血管蒂的肠管进行脱细胞处理，在脱细胞肠管上种植平滑肌细胞和尿路上皮细胞构建组织工程膀胱壁，再利用内皮祖细胞将脱细胞的动静脉蒂进行内皮化，成功构建带有血管蒂的膀胱组织并将血管蒂的动静脉分别与髂外动静脉进行端侧吻合。术后1～3 h，植入组织血流通畅，无血栓形成；而未种植内皮祖细胞的膀胱组织则在30 min内观察到血栓形成，血流停滞。

4.5 利用体内富含血管网的组织

将体外构建的组织植入体内时，用富含血管网的组织包裹，启动炎症性的创伤-愈合应答，同时由于缺氧而导致内源性生长因子的释放，可促进植入物周围的宿主血管内皮细胞的迁移、增殖，长入植入组织而使植入组织血管化[18]。大网膜是富含血管网的组织，以往的研究表明，预先将胶原海绵包裹在猪的大网膜内一周，使其预血管化，然后用于膀胱替代，能促进膀胱再生[39]。临床实验也表明，在行膀胱扩大成形术时，利用大网膜包裹组织工程膀胱，术后能够明显改善膀胱功能，膀胱容量、膀胱充盈最大压力、膀胱顺应性比不用大网膜包裹改善明显[2]。但是这种依靠刺激宿主血管长入的过程较漫长，其血管化效应还需进一步研究。

5 组织工程膀胱血管化的检测

实验研究中，体外观察血管化效应往往是取出植入物进行实验室检测来完成的；而如何进行组织工程膀胱血管化的体内监测，是组织工程膀胱研究和应用中亟待解决的问题。

组织工程膀胱血管化的监测应遵循监测灵敏、无创、无辐射、可定量、低成本、操作方便等原则。激光多普勒具有实时动态、灵敏度高、易操作、无特殊禁忌症、可重复性强和无放射性损伤等优点。因此，在组织工程血管化研究中，激光多普勒技术在体进行植入组织的血流动力学监测具有较强实用性[40]。动态对比增强磁共振技术，因其具有独体的捕捉组织及其新陈代谢能力，可反应微血管情况及毛细血管灌流情况，用以评估局部组织活力和功能，可以对组织工程膀胱血管化的微血管密度，平均微血管面积进行监测[41－42]。此技术无离子放射，具有较高的空间分辨率，且能进行结构和功能评价，具有很高的应用价值。

6 结语和展望

组织工程膀胱可预制成形，克服处于泌尿系而引起的不利，极具应用前景。但是组织工程膀胱的血管化仍是亟待解决的问题，需要进一步明确新生血管形成机制。进一步发展组织工程膀胱血管化策略，联合应用多种促血管化方法，以协同促进组织工程膀胱血管化的实现。

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Q813.1+3

B

1673－0364（2009）－01－0052－04

2008年8月6日；

2008年9月11日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.01.016

210008江苏省南京市南京大学医学院附属鼓楼医院泌尿外科。