胃癌的基因治疗研究

310007 南京军区杭州疗养院 田雅军 徐展 吕珍

·综述·

胃癌的基因治疗研究

310007 南京军区杭州疗养院 田雅军 徐展 吕珍

肿瘤从本质上说是一种多基因病，其发病涉及多阶段的基因事件，最终导致正常细胞转变成肿瘤细胞。肿瘤的基因治疗是通过转入核苷酸序列进入正常细胞或肿瘤细胞，导致肿瘤细胞直接死亡，改变针对肿瘤的免疫反应，或纠正某些基因的异常，逆转肿瘤的恶性进程，增强肿瘤细胞对放疗和化疗的敏感性，提高正常组织细胞对放、化疗毒副反应的耐受力，最终达到缩小和消灭肿瘤的目的。基因治疗中最基本的问题是：①如何选择目的基因。②将目的基因高效地导入载体与靶细胞，并在其中表达。③能有效地回输至体内，并发挥作用[1]。胃癌为一高发、高恶性度、预后不良的恶性肿瘤，长期以来临床手术切除及辅助性化疗、放疗措施的应用，并没有带来满意的生存率，其死亡率在我国居恶性肿瘤的首位。胃癌发生发展过程中的基因改变近年来受到重视，如何用基因方法或以基因作为靶点来防治胃癌亦成为近年来研究的热点。本文对近几年国内外胃癌的基因治疗进展作如下综述。

1 胃癌发病的分子基础[2]

1.1 抑癌基因的变化①p53基因的错义突变、框架移位和杂合性缺失(LOH)，在胃癌和肠化异型增生病变中被发现。②APC基因在20%～50%胃癌中产生突变，APC突变出现在胃癌的启动早期，其LOH在弥漫型胃癌中有较高发生率，提示其基因产物可影响细胞黏附能力和移动性。③DCC基因表达的降低与黏膜细胞的黏附特性改变及生长调节失控有关，其LOH可在50%肠型胃癌中发现。

1.2 癌基因的变化①bcl-2基因过度表达时可抑制凋亡，并在上皮细胞的永生化中起作用，它可参与肠型胃癌的早期启动。②c-erbB2过度表达在90%肠型胃癌中出现。③c-met和k-sam与弥漫型胃癌有关，c-met过度表达导致肿瘤进展。

1.3 其他分子改变CD44基因的变异、细胞周期的负调节因子p21和p27的表达缺失、端粒酶的活性阳性、E-钙粘蛋白基因的LOH和突变等常在胃癌中被检测到。

2 胃癌相关基因[3]

2.1 癌基因已知与胃癌相关的癌基因有:c-myc，ras，hst，c-erbB-2，k-sam，n-myc，met，p53（突变型）等。它们通过点突变、扩增或易位在肿瘤的启动、促癌以及进展阶段过度表达，引起胃黏膜上皮细胞转化和无限制的增殖，最终导致胃癌的形成、发展和转化。在各种癌基因中ras基因特别是h-ras基因与胃癌的关系比较密切，其所编码的蛋白质rasp12具有调节细胞生长和分化的功能，它的异常表达对细胞恶变和胃癌的恶性表型起着重要作用。此外，还有一些分子与胃癌细胞的增殖、分化、转移等恶性行为有关。如增殖细胞核抗原(PCNA)、端粒酶、转化生长因子-β1(TGF-β1)、免疫抑制酸性蛋白(IAP)等。

2.2 抑癌基因抑癌基因存在于正常细胞中，是细胞正常增殖的稳定因素，Rb基因是最早发现的人体抑癌基因。此后陆续发现了多种抑癌基因，和胃癌有关的有p53，DCC，APC，MCC等。p53基因是迄今发现的与人类肿瘤相关性最高的基因，定位于17号染色体短臂上。野生型p53基因（AdCA p53）在细胞损伤修复过程中，监视着基因组DNA的完整性。当细胞受到射线或某些药物作用而发生DNA损伤时，p53基因所编码的蛋白能使细胞分裂停止在G1/S期，使细胞充分修复DNA的损伤使之恢复正常。倘不能恢复，野生型p53基因还能启动细胞的凋亡过程从而引导细胞的程序性死亡，阻止具有癌变倾向的突变细胞出现。但野生型p53基因很容易发生突变，转变成突变型p53基因。突变型p53基因不但丧失了抑制肿瘤发生的作用，反而具有致癌作用，成为癌基因。定位于18号染色体长臂的DCC基因，定位于5号染色体短臂的APC基因和MCC基因也是近年来发现的抑癌基因，它们的缺乏或突变常见于结、直肠癌，也可在胃癌中发现。此外nm23和p16基因也被认为是肿瘤抑制基因。

3 胃癌的基因治疗策略

3.1 基因置换基因治疗基因置换是转移外源正常基因或超常活化的基因取代异常有缺陷的肿瘤抑制基因。目前在胃癌基因治疗研究中最多的是p53和GCF两个抑癌基因。

研究较深入的是p53基因置换治疗。Steele等[4]报告有大约60%胃癌患者的肿瘤细胞有p53基因的点突变，由于p53基因表达的核蛋白被认为在细胞DNA损伤后的细胞调控中处于中心地位，因此应用野生型p53基因进行基因置换治疗胃癌极具吸引力。Ohashi等[5]研究了重组腺病毒介导的野生型p53基因转染治疗胃癌细胞株MKN1、MKN7、MKN28、MKN45、TMK-1在体外和动物体内的作用，结果表明，导入了野生型P53基因的人胃癌细胞株生长明显受抑制，而未导入的表现为p53基因的细胞株则无此现象；流式细胞仪和DNA检测表明，AdCA p53对胃癌细胞的机制是导致细胞凋亡。此外，野生型p53基因置换后的肿瘤细胞能恢复对放疗、化疗的敏感性[6]。因此，p53基因置换治疗胃癌是一种可行的有效方法。GCF基因置换治疗：GCF基因是一种与人类胃癌有密切关系的抑癌基因，其结合于表皮生长因子受体基因启动子上富含GC核苷酸序列的特异性区域，能够抑制表皮生长因子受体基因的转录，从而降低转化生长因子、胰岛素样生长因子Ⅱ等其他生长因子的表达。Kitadai等[7]将GCF基因转染人胃癌细胞株TMK-1和MKN-28，结果被转染的细胞株不能在无血清的培养基中生长，动物试验同样证实转染了该基因的胃癌细胞接种于裸鼠皮下，其生长明显减慢。

3.2 反义核酸基因治疗反义基因治疗就是应用反义核酸在转录和翻译水平阻断某些异常基因的表达，以期阻断瘤细胞内的异常信号传导，使瘤细胞进入正常分化轨道或引起细胞凋亡，或抑制自分泌生长因子的分泌，封闭其受体以改变肿瘤的生物学特性达到治疗肿瘤的目的。

增殖细胞核抗原(PCAN)是一种能通过δ-DNA聚合酶诱导DNA合成的核蛋白，其基因表达在胃癌细胞中显著增高，并与胃癌的侵袭、转移有关，因此利用反义基因技术，合成PCAN的反义cDNA与其相互作用，以抑制或封闭其表达。Sakakura等[8]构建了反义寡核苷酸的真核表达质粒，将其转染入7种不同的胃癌细胞株，发现转染后的胃癌细胞与亲本细胞相比，其生长速度均有不同程度的抑制，软琼脂集落形成能力减弱，活性降低，并在10～40 mmol/L的浓度下具有剂量、效应关系。这一结果表明，PCAN与胃癌细胞的异常增殖有关，通过反义技术抑制PCAN基因的表达可对胃癌细胞的恶性表型产生逆转作用，达到控制胃癌生长作用。因此采用反义技术来封闭PCAN的表达不失为胃癌基因治疗的一条途径。Bcl-2基因亦是一种细胞凋亡抑制基因，它是通过影响细胞内Ca2+通道及IL-2β转化酶(ICE)的表达和释放而抑制细胞凋亡，并与bax、TNF、Fas的结合与调节有关，它虽不促进细胞增殖，但可明显延长细胞的存活时间，在胃癌中常有过度的表达。肖冰等[9]采用反义核酸技术构建Bcl-2反义真核表达载体(PDOR-Bcl-2-cDNA)，采用脂质体转染胃癌细胞株SGC-7901，结果发现转染反义重组基因的胃癌细胞Bcl-2的表达明显减少，说明反义Bcl-2可以有效阻止胃癌细胞Bcl-2的表达。c-myc癌基因是一种细胞凋亡抑制基因，其蛋白产物是调节细胞生长、分化的一种重要转录激活因子。在多数情况下，基因表达是细胞分裂周期中进入S期所必需的。肿瘤细胞常伴有基因表达失控。Chen等[10]在体内及体外用重组反义c-myc腺病毒治疗人胃癌的研究发现，在SGC-7901细胞Ad-Asc-myc强烈抑制细胞生长和诱导细胞凋亡，对胃癌的基因治疗来说，其具有潜在的临床使用价值。

3.3 免疫基因治疗由于在肿瘤的发生发展过程中存在着机体免疫系统对肿瘤细胞的免疫耐受状态，而这种状态可能是既源于肿瘤细胞本身的免疫原性不强（如MHC表达不足），也可源于抗原递呈细胞(APC)不能提供足够的共刺激信号（如B7）或机体免疫因子分泌不足，或肿瘤细胞诱导机体的免疫抑制。基因免疫治疗的主要原则是提高宿主对肿瘤的免疫力。可以将某些细胞因子或黏附分子的基因转染到机体免疫细胞或癌细胞中，以提高机体免疫系统对肿瘤细胞的识别和反应能力。目前肿瘤细胞靶向的细胞因子基因治疗研究较多，该疗法以主动性免疫治疗为基础，即将细胞因子基因转染入肿瘤细胞中，制备出免疫原性更强的新型瘤苗，以激发机体产生显著的抗肿瘤免疫功能从而达到治疗肿瘤的目的。目前用于胃癌基因治疗的细胞因子主要有TNF，IL-2，4，6，IFL-γ，GM-CSF等，均收到不同程度的治疗效果。周志强等[11]构建人IL-2及IL-4真核表达载体，转染人胃癌细胞株SGC-7901，发现转基因细胞表达有活性的IL-2及IL-4，基因转导不改变胃癌细胞的体外生长特性，并能增强LAK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，降低或消除胃癌细胞的体内致瘤性，并且发现转基因细胞经大剂量射线照后，仍可以持续分泌IL-4，3～4周。证明该种瘤苗的安全性。Matsubara等[12]用逆转录病毒分别将IL-2，IL-4及GM-CSF基因导入胃癌细胞后，观察射线对这些细胞代谢及细胞因子分泌的影响，所有细胞在接受6 Gy照射后细胞代谢部分抑制，剂量为20 Gy时完全抑制细胞代谢，而细胞因子的分泌则不受影响，即使在60 Gy照射后仍可检测到有细胞因子分泌，这些特性对于设计新型瘤苗将是非常有益的。

3.4 自杀基因治疗人们将正常细胞的程序性死亡称为细胞自杀(cell suicide)，随着对细胞自杀机制的研究，发现某些来自病毒或细菌的基因的表达产物可将原先对哺乳动物细胞无毒性或极低毒性的药物转换成毒性产物，从而导致这些细胞的死亡。因此，将这类基因转入某一靶细胞，使之对某些药物有特别的敏感性，利用这些药物使其死亡，这类基因被称为“自杀基因”。由于自杀基因的表达产物大多为将无毒性前体转换为毒性产物的酶类，故又称为“前药转换酶基因”。这种治疗称为肿瘤的“自杀基因”治疗。目前，已发现和克隆的“自杀基因”有多种，如单纯疱疹病毒的tk基因(HSV-tk)、胞嘧啶脱氨酶基因(CD)、细胞色素P-450基因等，其中HSV-tk和CD是目前应用最多的基因。Yoshida等[13]通过逆转录病毒介导HSV-tk转染人胃癌TMK-1细胞株，再予以丙氧鸟苷(GCV)后，该胃癌细胞株的增殖明显受到抑制。Tanaka等[14]将癌胚抗原(CEA)特异性启动子和增强子组成的转录调控序列插入已经含HSV-tk的逆转录病毒载体后转染至表达CEA胃癌细胞的效率大大提高。与应用常规启动子构建的HSV-tk相比，CEA启动子和增强子构建的HSV-tk转染胃癌细胞后应用GCV治疗，可明显提高其对表达CEA胃癌细胞的杀伤作用[15]。40%的胃癌表达CEA，因此这些表达CEA的胃癌细胞株对该治疗方法极为敏感。Lan等[16]以带有CEA启动子的腺病毒为载体，将CD转染人胃癌细胞株MKN-45后接种于小鼠，对荷瘤小鼠全身性氟尿嘧啶(5-FU)治疗，结果移植瘤生长显著受抑，荷瘤小鼠存活期明显延长，5-FU的不良反应较对照组明显减轻。

3.5 端粒酶的基因治疗端粒酶存在于各种恶性肿瘤细胞中，它具有复制染色体末端DNA，延长端粒长度和维持细胞增殖能力的作用，它的活化是恶性肿瘤细胞无限制增殖的重要基础。杨金亮等[17]将人端粒酶RNA(hTR)基因反向重组真核表达载体pcl-neo中，转染SGC-7901细胞，发现转染细胞的生长明显减慢，软琼脂中无克隆形成，在1×107个转染细胞接种到裸鼠皮下均无肿瘤形成，进一步研究发现，转染细胞p21基因表达增高，p27、Bcl-2和c-myc基因的表达下降。Shay等[18]对3 500例各种不同的肿瘤及其正常组织中端粒酶活性进行分析，发现绝大多数肿瘤细胞表达端粒酶，而正常组织中端粒酶多呈阴性，从而认为端粒酶的活化稳定了肿瘤细胞严重缩短的端粒，使过度增殖的细胞恶性变或永生化，而缺乏端粒酶的细胞则很快死亡。文献研究表明胃癌中端粒酶阳性率高达92.3%，而正常胃黏膜中无端粒酶表达，因此端粒酶不仅可以作为肿瘤的诊断指标，更可以作为肿瘤基因治疗的靶位。

3.6 耐药基因治疗各种肿瘤包括胃癌在内对化疗药物产生多耐药性及大剂量化疗药物对骨髓的抑制作用是目前临床化疗失败的主要原因。肿瘤的多耐药表现为对结构、作用机制及作用部位各不相同的化疗药的交叉耐药。近年来研究较多的是P-糖蛋白和编码其多耐药基因MDR1。P-糖蛋白是分布在细胞膜上的正常糖蛋白。暴露于多种毒物环境的组织细胞，如消化系组织细胞，在生理条件下就含有较多的P-糖蛋白。P-糖蛋白是一种能量依赖药物外排泵，以ATP作为能源，将某些化学药物泵出细胞外。目前发现与P-糖蛋白有类似作用的尚有多种耐药相关蛋白(MRP)及肺耐药相关蛋白(LRP)。肿瘤细胞过度表达，P-糖蛋白或MRP能减少细胞内药物聚积或可变药物在细胞内的分布而降低化疗效果。对MDR的特性尽可能地保护骨髓组织免受化疗药物的抑制。将MDR转入造血干细胞中可以保护荷瘤宿主抵抗大剂量化疗所致的损伤。这种基因治疗方法可以很好的增加肿瘤化疗的效果。

4 胃癌基因治疗问题和展望

肿瘤的基因治疗是随分子生物学理论和技术的发展而在近年兴起的一种新的治疗方法。胃癌的基因治疗目前只在于动物试验研究，还未在临床上进行实际应用。其主要原因，第一是由于技术的复杂性，很难制成生物制品来用于临床治疗，第二是基因治疗中病毒载体的安全性问题尚未解决，第三靶细胞种类的选择，基因表达水平对基因治疗效果以及患者本身的影响问题。今后胃癌基因治疗的发展方向应是：①加强对胃癌基因变化规律的认识，针对关键突变基因，运用基因置换和反义核酸等基因治疗策略。②改进基因转导技术，发现一种更简单、安全有效的载体，实施基因定位导入，提高转导率和外源基因的表达率。③进一步扩大基因受体细胞种类的筛选，提高受体细胞的扩增。

胃癌的基因治疗将来成为肿瘤综合治疗的一部分，可以提高化疗、放疗的敏感性，对减少肿瘤的复发和转移起一定作用，甚至是明显的作用。

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