盐酸特比萘芬乳膏抑菌效力考察及抑菌剂使用评价

摘" 要：对12家企业的盐酸特比萘芬乳膏进行抑菌效力测定，评价不同抑菌剂种类及浓度的抑菌效力。依据《中国药典》2020年版四部，选取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌和黑曲霉4株试验菌，进行方法适用性试验并评价抑菌效力。2家企业的盐酸特比萘芬乳膏抑菌效力仅能达到“B”级标准，其余10家均达到“A”级标准。12家企业中使用苯甲醇、苯氧乙醇作为抑菌剂对金黄色葡萄球菌的抑菌效果不佳，而使用羟苯乙酯作为抑菌剂对黑曲霉的抑菌效果不佳，使用苯扎溴铵的1家可以达到良好的抑菌效果。12家企业的盐酸特比萘芬乳膏抑菌效力均是可以接受的，存在抑菌剂过量使用现象。建议筛选安全有效、科学合理的抑菌剂种类及添加量，保障人民群众用药安全。

关键词：盐酸特比萘芬乳膏；方法适用性试验；抑菌效力；抑菌剂；添加量

中图分类号：R917" " " 文献标志码：A" " " " " 文章编号：2095-2945（2025）06-0056-05

Abstract： The antibacterial efficacy of terbinafine hydrochloride creams from 12 companies was tested to evaluate the antibacterial efficacy of different types and concentrations of antibacterial agents. According to the \"China Pharmacopeia\" 2020 Edition Volume IV， four test bacteria， namely Staphylococcus aureus， Pseudomonas aeruginosa， Candida albicans and Aspergillus niger， were selected to conduct method suitability test and evaluate antibacterial efficacy. Two companies can only meet the \"B\" level standard in antibacterial effectiveness， while the remaining 10 companies all meet the \"A\" level standard. Among 12 companies， the use of benzyl alcohol and phenoxyethanol as bacteriostatic agents had poor antibacterial effect on Staphylococcus aureus， while the use of ethyl hydroxyphenolate as bacteriostatic agent had poor antibacterial effect on Aspergillus niger. One company using benzalkonium bromide can achieve good antibacterial effect. The antibacterial effect of terbinafine hydrochloride creams from 12 companies is acceptable， and there is excessive use of antibacterial agents. It is recommended to screen safe， effective， scientific and reasonable types and additions of bacteriostatic agents to ensure the safety of people's medication.

Keywords： terbinafine hydrochloride cream; method suitability test; antibacterial efficacy; bacteriostatic agent; addition amount

抑菌剂用于抑制外来微生物生长，《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）2020年版四部明确规定，多剂量规格的制剂在使用或储存过程中为了防止微生物污染、增殖，需加入合适的抑菌剂保证药物安全[1]。抑菌效力检查法用来测定无菌制剂或非无菌产品的抑菌活力，从而确定抑菌剂添加的种类及浓度大小[1]。

盐酸特比萘芬是一类广谱抗真菌药物，在真菌形成细胞膜时，特异性的抑制麦角鲨烯环氧化酶，进而杀灭或抑制真菌，对黑曲霉作用尤为突出[2]。有多种剂型，如乳膏、凝胶、片剂等。抑菌剂添加量在达到最佳效果的前提下越少越好。李辉等[3]指出目前市售多剂量包装的药品大部分添加了抑菌剂，存在的问题主要是种类选择、抑菌体系不合理，过量添加。通过国家评价性抽验对多个国产滴眼液含的抑菌剂研究发现，抑菌剂种类多，同样的抑菌剂在不同的厂家产品中添加量截然不同，抑菌剂滥用现象频繁发生[4]。本研究旨在探索市售盐酸特比萘芬乳膏中添加抑菌剂种类、含量是否合理，是否存在过量添加问题。

1" 仪器和材料

1.1" 仪器

TE212-L电子天平（Sartorius）；WH-21C生化培养箱（维根斯）；WH-21C霉菌培养箱（维根斯）；YT-606型集菌仪（杭州盈天科学仪器有限公司）；NU-543-500S生物安全柜（NuAire公司）；Seven Multi S40N pH/电导率/离子综合测试仪（梅特勒）。

1.2" 培养基及试剂

胰酪大豆胨琼脂培养基（批号：210713，北京三药，通过适用性检查）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（批号：211008，北京三药，通过适用性检查）、含1%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号：N1661Y，广东环凯）、2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC，批号：230808P10，广东环凯）、十四烷酸异丙酯（批号：RH243693，罗恩）。

1.3" 菌种

金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]（批号：B0521KJ， C0367KJ）、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]（批号：B0553KJ、B0903KJ）、白色念珠菌[CMCC（F）98001]（批号：B0112KJ、C0424KJ）、黑曲霉[CMCC（F）98003]（批号：B0962KJ、C0326KJ），采购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.4" 样品信息

市售的盐酸特比萘芬乳膏使用的抑菌剂有苯甲醇、苯氧乙醇、羟苯乙酯、苯扎溴铵。本研究选取12批供试品，包含4种抑菌剂，覆盖不同的浓度、厂家。样品信息如下（顺序为厂家，批号，规格，抑菌剂种类浓度）：A，221001，15 g∶0.15 g，苯甲醇8 g·1 000 g-1；B，220 903，1%，苯甲醇10 g·1 000 g-1；C，221003，1%，羟苯乙酯1.6 g·1 000 g-1；D，UA6U，1%，苯甲醇10 g·1 000 g-1；E，20220902，1%，苯甲醇10 g·1 000 g-1；F，2L010N15，10 g∶0.1 g，苯甲醇10 g·1 000 g-1；G，221104，1%，羟苯乙酯1 g·1 000 g-1；H，220615，1%（10 g∶0.1 g），羟苯乙酯0.3 g·1 000 g-1；I，2206001J，1%，羟苯乙酯2 g·1 000 g-1；J，220510，1%（10 g∶0.1 g），羟苯乙酯0.8 g·1 000 g-1；K，833001，1%，苯扎溴铵1 g·1 000 g-1；L，6212412，1%，苯氧乙醇8 g·1 000 g-1。

2" 方法与结果

2.1" 供试品制备

称取供试品10.00 g加入十四烷酸异丙酯20 mL，40 ℃的含1%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液70 mL，混匀，制成1∶10的供试液。取1∶10供试液20 mL加入80 mL含1%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，制成1∶50供试液。

2.2" 菌液制备

将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉各3颗分别溶于0.3 mL 0.9%无菌氯化钠溶液中，充分混匀，使每0.1 mL含菌数约103 cfu。

2.3" 方法适用性试验

本研究选择4种抑菌剂且添加量最大的厂家进行方法适用性试验。依据《中国药典》2020年版四部通则1105、1106[1]，采用平皿法（1∶10）进行计数方法适用性试验，结果仅金黄色葡萄球菌达到50%以上，铜绿假单胞菌（1∶10，1 mL分5皿）可以达到50%以上，白色念珠菌1∶10供试液太白，影响计数，黑曲霉1∶10供试液回收率为0。1∶50、1∶100、1∶1 000供试液采用平皿法，黑曲霉的回收率均不能达到50%，薄膜过滤法采用1∶10供试液不同的样品会不同程度堵膜，甚至有的厂家1∶10无法完全过滤，最终选择1∶50供试液薄膜过滤，含1%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗500 mL/膜进行真菌计数，1∶10供试液1 mL分5皿进行细菌计数，最终回收率均在0.7～1.0范围内。

2.4" 抑菌效力试验及结果

2.4.1" 接种容器的选择

由于乳膏剂型的包装容器不便于按无菌操作技术接入试验菌液、混匀等，因此需将供试品转移至无菌塑料容器中，容器的选择参考张文燕等[5]做凝胶试验采用的容器，该容器不影响供试品的pH特性等。

2.4.2" 试验组菌液接种

取包装完整的供试品10.00 g转移至无菌容器中，供试品中接种金黄色葡萄球菌菌悬液0.1 mL，浓度为105～106 cfu·g-1，接种菌液体积是样品体积的1%，用无菌“L”涂布棒充分搅拌均匀，置23 ℃避光保存。铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉同法操作。12批供试品依次操作。

2.4.3" 初始菌数测定

取0.9%氯化钠注射液10 mL，接种金黄色葡萄球菌菌悬液0.1 mL，使接种后含菌量为105～106 cfu·mL-1，充分混匀，进行10倍稀释测定菌液浓度，并换算成lg值，作为供试品中初始菌数lg值，结果见表1。

2.4.4" 供试品检查

取包装完整的供试品10.00 g转移至无菌塑料容器中，置23 ℃避光保存。在各间隔时间点2 d、7 d、14 d、28 d分别取无菌塑料容器中供试品进行计数及霉菌和酵母菌总数计数。12批样品的需氧菌总数为小于10 cfu·g-1，霉菌和酵母菌总数均为小于50 cfu·g-1。

2.4.5" 活菌数测定

依据《中国药典》2020年版四部通则1121抑菌效力检查法表2-2的规定[1]，在各间隔时间点2 d、7 d、14 d、28 d分别取无菌塑料容器中供试品，细菌数测定（金黄色葡萄球菌试验组、铜绿假单胞菌试验组、供试品检查组）取1∶10供试液1 mL分5皿（0.2 mL/皿），注入胰酪大豆胨琼脂培养基。真菌（白色念珠菌试验组、黑曲霉试验组、供试品检查组）取1∶50供试液1 mL加入100 mL含1%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，薄膜过滤，用含1%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗5次，每次100 mL/膜，贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基上。依据存活菌数测定的结果，计算并换算出各间隔时间点的lg值，及其与初始lg值比较减少的lg值。12批供试品测定结果见表1。12个厂家均符合《中国药典》四部“皮肤给药制剂”的判定标准[1]。其中C、F两个厂家仅能达到“B”标准。

3" 讨论

3.1" 抑菌效力方法适用性试验

目前关于盐酸特比萘芬乳膏的微生物限度检查方法的文献很少，吴鑫等[6]的研究依据为《中国药典》2010年版，众所周知，《中国药典》2015年版与2010年版关于微生物限度检查方法验证变化很大，同一种药品根据两版药典得出来的方法是不同的。蔡金莲[2]报导的方法是液体石蜡萃取法，试验步骤繁多，且抑菌效力试验的取样量为1 g（1 mL），萃取法提取的供试液不够整个实验。调研各厂家采用的方法各异。本试验旨在研究一种操作简单，适于多批次抑菌效力检查的方法。根据抑菌剂种类及浓度选择4个厂家进行验证，多次探索试验结果显示，盐酸特比萘芬乳膏10.00 g在十四烷酸异丙酯20 mL及40 ℃的含1%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液70 mL中溶解良好，细菌计数采用1∶10平皿法（分5皿）。真菌计数采用1∶50供试液，薄膜过滤，用40 ℃的含1%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗500 mL/膜，100 mL/次。为之后盐酸特比萘芬乳膏微生物限度检查方法提供参考。

3.2" 抑菌效力

表1结果显示不同企业盐酸特比萘芬乳膏（规格：1%）分别加入苯甲醇、羟苯乙酯、苯扎溴铵和苯氧乙醇等抑菌剂。A、B、D、E、G、H、I、J、K、L生产的盐酸特比萘芬乳膏对细菌（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌）的抑制作用在间隔2 d减少的lg值均大于2，间隔7 d的lg值均大于3，且细菌的存活数量第28 d与第7 d比较，均未增加。同时上述10家企业生产的盐酸特比萘芬乳膏在间隔14 d真菌（白色念珠菌、黑曲霉）减少的lg值均大于2，第28 d与第14 d比较均未增加。因此，这10个厂家生产的盐酸特比萘芬乳膏抑菌效力测定结果均达到《中国药典》2020年版判断的“A”标准。

F生产的盐酸特比萘芬乳膏在间隔2 d的测定结果中，金黄色葡萄球菌减少的lg值为0.56，在间隔14 d减少的lg值大于3，第28 d与第14 d比较lg值未增加。C生产的盐酸特比萘芬乳膏在间隔14 d的测定结果中，黑曲霉减少的lg值为1，第28 d与第14 d比较lg值未增加。综上所述，F和C的产品抑菌效力测定结果均达到《中国药典》2020年版判断的“B”标准，没有达到“A”标准。依据《中国药典》2020年版四部1121的规定，“A”指应该达到的标准，抑菌剂可能带来风险的要达到“B”标准。因此，F和C的产品抑菌效力测定结果达到“B”是相对可以接受的。

3.3" 抑菌剂种类及浓度分析评价

12个厂家的产品中盐酸特比萘芬的含量均为1%，但是使用的抑菌剂是不同的，表2结果比较显示使用苯甲醇、苯氧乙醇作为抑菌剂对金黄色葡萄球菌的抑菌效果不佳，而使用羟苯乙酯作为抑菌剂对黑曲霉的抑菌效果不佳，不同种类的抑菌剂对铜绿假单胞菌、白色念珠菌的抑菌效果都可以达到最佳。

以苯甲醇为抑菌剂的产品中，B对金黄色葡萄球菌抑菌效果最好，但是苯甲醇浓度与B相同的原研D、E、F的产品对此菌的抑菌效果明显下降，F的甚至只达到“B”标准，这提示我们应综合考虑生产工艺、使用的原辅料、抑菌剂的添加工艺流程等方面因素来确定抑菌体系。

使用苯扎溴铵只有一个厂家，对细菌、真菌的抑菌效果良好，这与史春辉等[7]报道的苯扎溴铵抑菌性好，安全有效，广泛用于眼用制剂一致。

以羟苯乙酯为抑菌剂的产品中，H、J对黑曲霉抑菌效果最佳，G、I可以达到“A”级，C仅达到“B”级。但抑菌剂浓度最低的是H和J，浓度较高的G、I、C的抑菌效果却低于浓度低的2个企业产品。《中国药典》2020年版中要求，抑菌剂都具有一定的毒性，制剂中抑菌剂的量应为最低有效剂量。有多篇文献报导羟苯乙酯具低毒性，过量添加会影响人体健康，发生过敏、癌症等疾病[8-10]。同时，为了保证用药安全，成品制剂中的抑菌剂有效浓度应低于对人体危害的浓度。提示G、I、C中羟苯乙酯的添加量可能不是最低有效量，存在过度添加的隐患风险。

3.4" 展望

目前，文献研究抑菌效力较多的是滴眼液，乳膏剂等皮肤制剂鲜少报道，但是实际用药过程中，抑菌剂过量添加可能会刺激皮肤，通过伤口进入人体代谢[11]。周发友等[12]使用从样品中（含苯扎溴铵0.1 mg·mL-1）分离到一株洋葱伯克霍尔德菌进行抑菌效力试验，发现低浓度的抑菌剂不符合药典规定，这提示我们野生菌株活性可能高于试验标准菌株，评价产品抑菌效力应考虑生产环境等分离菌株。张静等[13]发现鲜竹沥中pH对苯甲酸、山梨酸等解离状态有影响。有研究报导多数萘敏维滴眼液过量添加苯扎溴铵[14]。

本研究发现部分厂家盐酸特比萘芬乳膏中抑菌体系有待进一步优化，结合药物原料、辅料的相互作用、pH、水活度等方面选择合适的抑菌剂种类及浓度，企业应筛选安全有效、科学合理的抑菌体系。监管部门应推进制定相关产品抑菌体系的规范，多方合力保障人民群众用药安全。

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第一作者简介：尉文霞（1989-），女，硕士，工程师，食品药品微生物检验员。研究方向为微生物检验。