马骨续筋胶囊通过SDF-1/CXCR4信号通路促进老年大鼠髋部骨折愈合

摘要：目的探讨马骨续筋胶囊对老年大鼠髋部骨折愈合及基质细胞衍生因子-1（SDF-1）/CXC型趋化因子受体4（CXCR4）信号通路的影响。方法构建老年大鼠髋部骨折模型，将造模成功大鼠随机分为模型组，马骨续筋胶囊低、高剂量组，马骨续筋胶囊高剂量+通路抑制剂（AMD3100）组，每组12只，另取12只健康大鼠作为对照组。X线片观察大鼠髋部骨折愈合情况并进行Garrett评分；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清骨折愈合相关炎症因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-10（IL-10）水平；CT扫描分析测定骨体积分数（BV/TV）与骨表面积/体积比（BS/BV）；免疫组化检测骨折愈合因子胰岛素样生长因子（IGF）-1、骨形态发生蛋白（BMP）-2表达；Western blot检测SDF-1/CXCR4信号通路相关蛋白表达。结果模型组较对照组Garrett评分、IL-10水平、BV/TV、BS/BV及IGF-1、BMP-2、SDF-1、CXCR4表达降低，TNF-α水平升高（P＜0.05）；马骨续筋胶囊低、高剂量组较模型组Garrett评分、IL-10水平、BV/TV、BS/BV及IGF-1、BMP-2、SDF-1、CXCR4表达升高，TNF-α水平降低（P＜0.05）；马骨续筋胶囊高剂量+AMD3100组较马骨续筋胶囊高剂量组Garrett评分、IL-10水平、BV/TV、BS/BV及IGF-1、BMP-2、SDF-1、CXCR4表达降低，TNF-α水平升高（P＜0.05）。结论马骨续筋胶囊可促进老年大鼠髋部骨折愈合，其作用机制可能与激活SDF-1/CXCR4信号通路有关。

关键词：髋骨折；骨折愈合；趋化因子CXCL12；受体，CXCR6；马骨续筋胶囊

中图分类号：R683文献标志码：A DOI：10.11958/20241261

Magu Xujin capsule promotes hip fracture healing in aged rats throughSDF-1/CXCR4 signaling pathway

HOU Xiuxiu，XING Baorui，FENG Yuanchao，ZHANG Yadi

Department of Trauma Orthopedics，Cangzhou Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Cangzhou 161001，China

Abstract：Objective To explore the effects of Magu Xujin capsule on hip fracture healing and stromal cell-derived factor-1/CXC chemokine receptor 4（SDF-1/CXCR4）signaling pathway in elderly hip fracture rats.Methods The hip fracture model of aged rats was established，and successfully modeled rats were randomly separated into the model group，the low-dose Magu Xujin capsule group，the high-dose Magu Xujin capsule group，the high-dose Magu Xujin capsule+pathway inhibitor group（the high-dose Magu Xujin capsule and AMD3100 group），with 12 rats in each group.An additional 12 healthy rats were selected as the control group.X-ray was used to observe the healing of hip fractures in rats，and Garrett score was performed.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was applied to detect serum levels of inflammatory factors related to fracture healing，such as tumor necrosis factor-alpha（TNF-α）and interleukin-10（IL-10）.CT scanning analysis was used to determine bone volume fraction（BV/TV）and bone surface area/volume ratio（BS/BV）.Immunohistochemistry was applied to detect the expression of fracture healing factor insulin-like growth factor-1（IGF-1）and bone morphogenetic protein-2（BMP-2）.Western blot assay was applied to detect the expression of SDF-1/CXCR4 signaling pathway related proteins.Results Garrett score，IL-10 level，BV/TV，BS/BV，the IGF-1，BMP-2，SDF-1 and CXCR4 expression were lower in the model group than those in the control group，while TNF-αlevel was higher（P＜0.05）.Garrett score，IL-10 level，BV/TV，BS/BV，IGF-1，BMP-2，SDF-1 and CXCR4 expression were higher in the low-dose and high-dose MaguXujin capsule groups than those in the model group，while TNF-αlevel was lower（P＜0.05）.Garrett score，IL-10 level，BV/TV，BS/BV，IGF-1，BMP-2，SDF-1 and CXCR4 expression were lower in the high-dose Magu Xujin capsule+AMD3100 group than those in the high-dose Magu Xujin capsule group，while TNF-αlevel was higher（P＜0.05）.Conclusion Magu Xujin capsule can promote hip fracture healing in aged rats，and its mechanism may be related to the activation of SDF-1/CXCR4 signaling pathway.

Key words：hip fractures;fracture healing;chemokine CXCL12;receptors，CXCR6;MaguXujin capsule

老年髋部骨折是临床常见骨科疾病，也是骨相关疾病致残、致死的主要原因之一。老年人机体功能衰退，骨质量及强度急速下降，致使摔倒等一些轻微损伤就能导致髋部骨折，严重影响老年人生活质量及生命安全［1］。目前主要通过手术方式治疗老年髋部骨折，但其疼痛剧烈且术后恢复时间长；另外，长期卧床易引发一系列并发症，严重影响生活质量［2］。故寻求安全高效药物促进老年髋部骨折愈合是目前的研究重点。马骨续筋胶囊由骨碎补、土鳖虫、煅自然铜、马钱子、续断、乳香、麻黄、没药、甜瓜子等多味中药材组方，具有消肿止痛、活血祛瘀、温散舒筋、续筋接骨的功效。研究显示，马骨续筋胶囊联合可调背伸外固定支具治疗胸腰椎压缩性骨折，可改善患者的骨代谢水平，增加骨密度，缓解疼痛［3］。基质细胞衍生因子-1（stromal cell derived factor-1，SDF-1）/CXC型趋化因子受体4（CXC-type chemokine receptor 4，CXCR4）信号通路参与机体多个生理病理进程，其中包括骨折愈合，上调SDF-1、CXCR4表达可诱导骨痂形成，改善骨痂微结构和力学性能，从而加快骨折部位的愈合［4］。本研究通过探究马骨续筋胶囊对老年髋部骨折大鼠骨折愈合及SDF-1/CXCR4信号通路的影响，为治疗老年髋部骨折寻求新策略。

1材料与方法

1.1实验动物及主要材料60只20月龄SPF级健康雄性SD大鼠购自郑州大学河南省实验动物中心，生产许可号：SCXK（豫）2022－0001，平均体质量（600±20）g。马骨续筋胶囊为本院院内制剂。CXCR4抑制剂AMD3100购自武汉博欧特生物科技有限公司。肿瘤坏死因子（TNF）-α和白细胞介素（IL）-10酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自杭州联科生物技术股份有限公司；兔源多克隆胰岛素样生长因子（IGF）-1、骨形态发生蛋白（BMP）-2一抗购自武汉菲恩生物科技有限公司。兔源多克隆SDF-1、CXCR4一抗购自上海恒斐生物科技有限公司。兔源多克隆β-actin一抗、HRP标记的山羊抗兔二抗购自上海雅酶生物医药科技有限公司。BX51显微镜购自日本Olympus公司。ReadMax1500型酶标仪购自上海闪谱生物科技有限公司。4200SF型凝胶成像分析系统购自上海天能公司。

1.2方法

1.2.1老年大鼠髋部骨折模型构建麻醉固定大鼠，消毒后在髋部中心左右定位切口，暴露并固定髋关节，骨科牙钻完全离断髋部中段，暴露骨髓腔，克氏针双侧逆行插入骨髓腔内固定，逐层缝合伤口，给予加热毯保温并注射青霉素预防感染［5］。若活动大鼠下肢明显可见骨折断端分离、畸形、移位等骨折特有体征，表示造模成功。

1.2.2分组与处理采用简单随机抽样将造模成功大鼠分为模型组，马骨续筋胶囊低、高剂量组和马骨续筋胶囊高剂量+AMD3100组，每组12只；另取12只健康大鼠作为对照组。马骨续筋胶囊低、高剂量组分别每日3次服用中成药马骨续筋胶囊1.5、3 g，服药剂量根据人与大鼠之间剂量换算而得［6］，马骨续筋胶囊高剂量+AMD3100组每日3次服用中成药马骨续筋胶囊3 g及每12 h皮下注射AMD3100 0.86 mg/kg，注射剂量根据大小鼠之间剂量换算而得［7］；连续治疗12周。

1.2.3髋部骨折愈合情况检测各组大鼠给药结束后处死，取髋部组织，X线片观察大鼠髋部骨折愈合情况并进行Garrett评分。0分，无桥接、骨痂生成；1分，无桥接，骨折端附近有明显原始骨痂形成；2分，至少一侧皮质有骨桥，骨折端周围骨痂形成显著；3分，双侧骨皮质均有骨桥，并且骨痂塑形。

1.2.4骨折愈合相关炎症因子水平检测各组大鼠处死前尾静脉取血，静置后3 000 r/min离心15 min，取血清，ELISA试剂盒检测血清TNF-α和IL-10水平。

1.2.5骨体积分数与骨表面积/体积比检测X线片观察结束后，每组取6个髋部组织置于4%多聚甲醛，然后采用CT扫描检测骨体积分数（BV/TV）与骨表面积/体积比（BS/BV）。

1.2.6免疫组化检测骨折愈合相关蛋白表达将1.2.5髋部组织扫描后，制成石蜡切片常规脱蜡至水，抗原修复，清除内源性过氧化物酶，血清封闭，将切片与IGF-1、BMP-2一抗4℃冰箱孵育，次日与HRP标记的二抗孵育，再进行DAB显影，苏木精染色，漂洗后干燥密封，显微镜观察并收集图像进行光密度（OD）值分析。

1.2.7 Western blot检测SDF-1/CXCR4信号通路相关蛋白表达将各组剩余6个髋骨组织与预冷蛋白裂解液充分反应制成匀浆，提取总蛋白并定量，根据蛋白样大小进行SDS-PAGE，转PVDF膜后血清封闭，将膜与SDF-1、CXCR4一抗4℃冰箱孵育，次日与HRP标记的二抗孵育，ECL可视化处理，凝胶成像系统采集图像并进行灰度分析，计算相对表达量。

1.3统计学方法采用SPSS 25.0进行数据分析，计量资料均符合正态分布，以x±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1老年大鼠髋部骨折形态观察对照组大鼠活动下肢形体健康正常，模型组活动下肢明显可见骨折断端分离、畸形、移位等骨折特有体征，见图1。

2.2马骨续筋胶囊对骨折愈合情况的影响模型组较对照组Garrett评分降低（P＜0.05）；马骨续筋胶囊低、高剂量组较模型组Garrett评分升高（Plt;0.05）；马骨续筋胶囊高剂量+AMD3100组较马骨续筋胶囊高剂量组Garrett评分降低（P＜0.05）；见表1。

2.3马骨续筋胶囊对炎症因子水平的影响模型组较对照组TNF-α水平升高、IL-10水平降低（Plt;0.05）；马骨续筋胶囊低、高剂量组较模型组TNF-α水平降低、IL-10水平升高（P＜0.05）；马骨续筋胶囊高剂量+AMD3100组较马骨续筋胶囊高剂量组TNF-α水平升高、IL-10水平降低（P＜0.05）；见表1。

2.4马骨续筋胶囊对BV/TV与BS/BV的影响模型组较对照组BV/TV、BS/BV降低（P＜0.05）；马骨续筋胶囊低、高剂量组较模型组BV/TV、BS/BV升高（P＜0.05）；马骨续筋胶囊高剂量+AMD3100组较马骨续筋胶囊高剂量组BV/TV、BS/BV降低（Plt;0.05）；见表2。

2.5马骨续筋胶囊对髋骨组织骨折愈合因子表达的影响模型组较对照组IGF-1、BMP-2表达降低（P＜0.05）；马骨续筋胶囊低、高剂量组较模型组IGF-1、BMP-2表达升高（P＜0.05）；马骨续筋胶囊高剂量+AMD3100组较马骨续筋胶囊高剂量组IGF-1、BMP-2表达降低（P＜0.05）；见图2、表3。

2.6马骨续筋胶囊对髋骨组织SDF-1/CXCR4信号通路的影响模型组较对照组SDF-1、CXCR4表达降低（P＜0.05）；马骨续筋胶囊低、高剂量组较模型组SDF-1、CXCR4表达升高（P＜0.05）；马骨续筋胶囊高剂量+AMD3100组较马骨续筋胶囊高剂量组SDF-1、CXCR4表达降低（P＜0.05）；见图3、表4。

3讨论

中医认为骨折可造成经络受阻、气滞血瘀、筋骨失养，而行气止痛、活血祛瘀、强筋健骨则是促进骨折愈合的关键。马骨续筋胶囊中的骨碎补续伤止痛、温经通络、补肾强骨，土鳖虫和煅自然铜散瘀止痛、续筋接骨，马钱子散结消肿、通络止痛，续断补肝肾、续折伤、强筋骨，乳香行气活血，麻黄活血祛瘀、宣通阳气，没药活血散瘀、消肿生肌，甜瓜子散结消瘀，诸药合理配伍可除血瘀、通脉络，使气血通畅，关节筋肉得以濡养，强筋壮骨，促进术后骨折处的快速愈合［8］。研究显示，中医手法复位孟氏架固定术后加用马骨续筋胶囊治疗胫腓骨骨折患者，可有效改善患者临床症状，提高术后膝关节活动功能［9］。马骨续筋胶囊联合微创经皮椎弓根螺钉固定术治疗胸腰椎压缩性骨折患者，可促进骨折愈合，恢复伤椎正常生理结构，降低术后疼痛，改善骨代谢，提高各项生长因子水平［6］。本研究结果显示，马骨续筋胶囊可促进骨桥连接及骨痂生成，加快骨折愈合。

骨折愈合是一个包括炎性期、修复期、重建期的骨重建过程，其过程受炎症反应、营养水平、康复锻炼等多因素多机制影响［10-11］。其中，机体在骨折愈合炎性期出现血肿，骨折部位血管扩张、炎性细胞浸润，诱发炎症相关因子TNF-α等大量释放，提高破骨细胞的活性并促进其分化能力，使中性粒细胞对细胞碎片的吞噬作用增强，骨吸收能力提高，成骨细胞的合成受到抑制，进而影响骨折愈合［12-13］。有研究显示，抑制炎症因子TNF-α释放，减轻创伤性骨折大鼠炎症反应可促进骨折愈合［14］。IL-10过度表达可降低TNF-α水平，抑制炎症反应，促进骨形成，加速糖尿病小鼠股骨骨折修复［15］。本研究结果显示，马骨续筋胶囊可降低TNF-α水平、升高IL-10水平，抑制炎症反应，改善老年髋部骨折大鼠骨折愈合。

骨折愈合过程离不开骨生长因子的调控，因其在诱导成骨、合成骨基质、软骨骨化及重建局部微循环等过程中发挥重要作用。BMP-2可诱导未分化的间充质细胞分化为成熟软骨细胞和成骨细胞，被认为是较强的骨诱导分化因子；另外，其还可诱导间充质细胞迁徙、增殖、分化，促进成骨因子的表达和成骨细胞分化，诱导体外成骨，在骨愈合后期还可刺激破骨细胞分化，参与骨重建。IGF-1是一种结构类似胰岛素的多肽，可促进骨合成代谢，加速软骨细胞的增殖分化，促进骨形成；而骨折愈合过程中，其以自分泌、旁分泌的方式分泌，抑制胶原酶合成，减少胶原降解，促进骨基质合成与矿化。两者在骨愈合不同阶段共同发挥作用，刺激并诱导成骨细胞增殖分化，提高成骨细胞活性，增加骨量，促进骨折愈合。研究显示，上调BMP-2、IGF-I蛋白等骨折愈合因子的表达水平，可促进股骨骨折愈合［16］。而在颅骨缺损部位注射BMP-2和IGF-1，可促进颅骨缺损愈合［17］。本研究结果显示，马骨续筋胶囊可上调BMP-2、IGF-1表达，改善老年大鼠髋部骨折的愈合。

SDF-1/CXCR4信号通路可通过促进细胞增殖、归巢、募集参与骨折愈合进程，即当机体受到刺激时，SDF-1被激活并与其特异性受体CXCR4结合，参与促进成骨细胞增殖分化进程。研究显示，激活SDF‑1/CXCR4信号通路可促进成骨并募集间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs），加速颅脑损伤骨折愈合［18］，同时还可上调骨生成相关基因，改善骨折愈合，增加骨矿物质密度，增加骨强度［19］。本研究结果显示，马骨续筋胶囊可上调SDF‑1、CXCR4表达，促进老年髋部骨折大鼠骨折愈合，推测其可能通过激活SDF‑1/CXCR4信号通路促进骨折愈合。为验证这一猜测，本文利用SDF‑1/CXCR4信号通路抑制剂AMD3100处理马骨续筋胶囊高剂量组的髋部骨折老年大鼠，发现其可部分逆转马骨续筋胶囊对大鼠骨折愈合的促进作用。

综上所述，马骨续筋胶囊可促进老年大鼠髋部骨折愈合，其作用机制可能与激活SDF‑1/CXCR4信号通路有关。本研究尚存在不足之处，如马骨续筋胶囊对老年髋部骨折的作用机制尚不清楚，且本研究样本量也较小；老年髋部骨折发病机制是复杂的，但本研究仅从炎症及骨折愈合因子水平进行了探究，后续还需扩大样本进行深入探索论证。

参考文献

［1］MEAGHER E，VARGHESE S，HARTY J A，et al.The decline of hip fracture incidence rates over a 10-year period：a single centre experience［J］.Injury，2021，52（7）：1807-1812.doi：10.1016/j.injury.2021.04.051.

［2］张玉，孙炜，孙维超，等.入院红细胞体积分布宽度与老年髋部骨折术后肺部感染的关系及其预测价值［J］.天津医药，2022，50（6）：608-612.ZHANG Y，SUN W，SUN W C，et al.The predictive value of red cell distribution width for postoperative lung infection in elderly patients with hip fracture［J］.Tianjin Med J，2022，50（6）：608-612.doi：10.11958/20212647.

［3］周宝柱，刘道阔，张鹏，等.马骨续筋胶囊联合可调背伸外固定支具治疗胸腰椎压缩性骨折临床评价［J］.中国药业，2021，30（22）：104-107.ZHOU B Z，LIU D K，ZHANG P，et al.Clinical evaluation of Magu Xujin capsule combined with adjustable back extension external fixation brace in the treatment of thoracolumbar compression fractures［J］.China Pharmaceutical Industry，2021，30（22）：104-107.doi：10.3969/j.issn.1006-4931.2021.22.027.

［4］YE D，CHEN C，WANG Q，et al.Short-wave enhances mesenchymal stem cell recruitment in fracture healing by increasing HIF-1 in callus［J］.Stem Cell Res Ther，2020，11（1）：382.doi：10.1186/s13287-020-01888-0.

［5］周欣，石维祥，罗晓中.茶多酚对髋部骨折大鼠VEGF/VEGFR-2信号通路及炎症因子TNF-α和IL-10含量水平的影响［J］.临床和实验医学杂志，2021，20（17）：1812-1815.ZHOU X，SHI W X，LUO X Z.Effects of tea polyphenols on VEGF/VEGFR-2 signaling pathway and levels of inflammatory factors TNF-αand IL-10 in hip fracture rats［J］.Journal of Clinical and Experimental Medicine，2021，20（17）：1812-1815.doi：10.3969/j.issn.1671-4695.2021.17.006.

［6］周宝柱，刘道阔，张鹏，等.马骨续筋胶囊联合微创经皮椎弓根螺钉固定术对胸腰椎压缩性骨折愈合的影响［J］.中国药业，2022，31（1）：95-98.ZHOU B Z，LIU D K，ZHANG P，et al.Effect of Magu Xujin capsule combined with minimally invasive percutaneous pediclescrew fixation on the healing of thoracolumbar compression fractures［J］.China Pharmaceutical Industry，2022，31（1）：95-98.doi：10.3969/j.issn.1006-4931.2022.01.025.

［7］唐昊，陈顺有，卢晓坤，等.小鼠SDF-1/CXCR4介导的AKT与ERK通路抑制对延缓骨折愈合的影响［J］.中外医学研究，2020，18（19）：6-9.TANG H，CHEN S Y，LU X K，et al.Effect of inhibition of AKT and ERK pathways mediated by SDF-1/CXCR4on delayed fracture healing in mice［J］.Chinese and Foreign Medical Research，2020，18（19）：6-9.doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2020.19.003.

［8］侯秀秀，韩广普，石国君，等.老年股骨粗隆部骨折应用马骨续筋胶囊治疗的效果观察［J］.药店周刊，2021，30（1）：181.HOU X X，HAN G P，SHI G J，et al.Effect of Magu Xujin capsule on elderly patients with trochanteric fracture of femur［J］.Journal of Pharmacies，2021，30（1）：181.

［9］齐冰冰，李国梁.马骨续筋胶囊联合中医手法复位孟氏架治疗胫腓骨骨折的临床研究［J］.河北中医，2022，44（4）：569-573.QI B B，LI G L.Clinical study of Magu Xujin capsule combined with traditional Chinese medicine manual reduction of Mengzi frame in treatment of tibia and fibula fracture［J］.Hebei Traditional Chinese Medicine，2022，44（4）：569-573.doi：10.3969/j.issn.1002-2619.2022.04.010.

［10］KUSHIOKA J，CHOW S K，TOYA M，et al.Bone regeneration in inflammation with aging and cell-based immunomodulatory therapy［J］.Inflamm Regen，2023，43（1）：29.doi：10.1186/s41232-023-00279-1.

［11］WANG L，ZHANG G.Analysis of the effect of mini-nutrition nursing plus Baduanjin rehabilitation exercise on fracture healing，mobility and nutritional status of elderly patients with vertebral or hip fractures［J］.Biotechnol Genet Eng Rev，2024，40（3）：2508-2519.doi：10.1080/02648725.2023.2200302.

［12］TORRES H M，ARNOLD K M，OVIEDO M，et al.Inflammatory processes affecting bone health and repair［J］.Curr Osteoporos Rep，2023，21（6）：842-853.doi：10.1007/s11914-023-00824-4.

［13］JANTABOON S，SAKUNRANGSIT N，TOEJING P，et al.Lipopolysaccharide impedes bone repair in fcγriib-deficient mice［J］.Int J Mol Sci，2023，24（23）：16944-16961.doi：10.3390/ijms242316944.

［14］陈月，苗存良，安志辉，等.芹菜素调节OPG/RANKL/RANK信号通路对创伤性骨折大鼠骨折愈合的影响［J］.国际检验医学杂志，2023，44（12）：1446-1451.CHEN Y，MIAO C L，AN Z H，et al.Effect of apigenin regulating OPG/RANKL/RANK signaling pathway on fracture healing in rats with traumatic fracture［J］.International Journal of Laboratory Medicine，2023，44（12）：1446-1451.doi：10.3969/j.issn.1673-4130.2023.12.008.

［15］CUI K，CHEN Y，ZHONG H，et al.Transplantation of IL-10-overexpressing bone marrow-derived mesenchymal stem cells ameliorates diabetic-induced impaired fracture healing in mice［J］.Cell Mol Bioeng，2020，13（2）：155-163.doi：10.1007/s12195-019-00608-w.

［16］MOLLAHOSSEINI M，AHMADIRAD H，GOUJANI R，et al.The association between traumatic brain injury and accelerated fracture healing：a study on the effects of growth factors and cytokines［J］.J Mol Neurosci，2021，71（1）：162-168.doi：10.1007/s12031-020-01640-6.

［17］PARK Y，LIN S，BAI Y，et al.Dual delivery of BMP2 and IGF1 through injectable hydrogel promotes cranial bone defect healing［J］.Tissue Eng Part A，2022，28（17/18）：760-769.doi：10.1089/ten.TEA.2022.0002.

［18］XUE Y，LI Z，WANG Y，et al.Role of the HIF‑1α/SDF‑1/CXCR4 signaling axis in accelerated fracture healing after craniocerebral injury［J］.Mol Med Rep，2020，22（4）：2767-2774.doi：10.3892/mmr.2020.11361.

［19］ZHANG L，JIN L，GUO J，et al.Chronic intermittent hypobaric hypoxia enhances bone fracture healing［J］.Front Endocrinol（Lausanne），2020，11：582670.doi：10.3389/fendo.2020.582670.

（2024-09-03收稿2024-10-18修回）

（本文编辑李国琪）