三峡库区道地药材木香中12种真菌毒素的测定与分析

2025-01-31王文婷马英杰袁林罗长琴何世新贺灵芝

品牌与标准化 2025年1期

摘要：目的：建立超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/M）测定木香药材中12种真菌毒素的分析方法，并利用该方法对51批来自三峡库区生产企业和种植基地的样品进行检测分析。方法：溶剂为70%甲醇溶液，样品经过提取超声后，用HLB小柱净化；色谱柱为Waters Atlantisd C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，1.7μm），质谱条件为电喷雾电离源（ESI）和多反应监测模式（MRM）。结果：12种真菌毒素标准曲线线性关系良好（R>0.995），方法的检出限在0.1～3.8μg/kg之间，高、中、低3个不同浓度加标回收率为81.6%～100.5%，相对标准偏差（RSD，n=6）为1.88%～6.81%。在51份样品中，真菌毒素的检出率为9.8%；检出率最高的真菌毒素是ZEN，为9.8%，其次为T-2和FB1，均为3.9%，其他毒素检出率相对较低。结论：该方法检测快速、结果精准，可用于中药材样品中多种真菌毒素的检测分析。除了药典规定的黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮外，还应重点监督三峡库区道地药材中伏马毒素B1、伏马毒素B2和T-2毒素这三种真菌毒素的污染现状。

关键词：三峡库区；超高效液相色谱-串联质谱法；道地药材；真菌毒素

中图分类号：R282文献标志码：ADOI编码：10.3969/j.issn.1674-4977.2025.01.001

基金项目：重庆三峡医药高等专科学校重点实验室项目（Sys20210030）：三峡库区道地药材木香、黄精、陈皮和太白贝母真菌毒素安全性质量标准研究。

三峡库区常年温度适宜，湿度较大，为植被提供了较好的生长条件，但这种环境也加大了库区中药材被污染的风险[1]。在湿度高的地区，中药材在处理环节中可能因为干燥不彻底、储藏不当等因素受到真菌污染，进而影响其药用价值，严重时还会危害人的生命安全[2]。因此，本研究以木香为研究对象，对三峡库区道地药材中12种真菌毒素进行检测分析。

1实验部分

1.1仪器与试剂

TSQ Series超高效液相-质谱联用仪（美国Waters公司）；AB204S型天平（万分之一，瑞士梅特勒托利多公司）；TurbovapⅡ型自动吹氮仪（瑞典Biotage公司0；CNW Poly-Sery HLB Pro SPE柱（60 mg，3 mL/100 pcs，上海安谱公司）。

真菌毒素混合标准溶液（青岛普瑞邦生物工程有限公司）：黄曲霉毒素B1（AFB1，0.502μg/mL）、黄曲霉毒素G1（AFG1，0.503μg/mL）、黄曲霉毒素B2（AFB1，0.502μg/mL）、黄曲霉毒素G2（AFG2，0.503μg/mL）、玉米赤霉烯酮（ZEN，5.03μg/mL）、T-2毒素（T-2，50.93μg/mL）、伏马毒素B1（FB1，10.0μg/mL）、伏马毒素B2（FB2，10.04μg/ mL）、伏马毒素B3（FB3，10.18μg/mL）、呕吐毒素（DON，50.01μg/mL）、赭曲霉毒素A（OTA，0.500μg/mL）、赭曲霉毒素B（OTB，50.06μg/mL）。甲醇、乙腈等试剂均为色谱级（迪马科技有限公司），水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

准确移取标准溶液适量，用50%乙腈稀释并定容，配制成质量浓度分别为0.0502μg/mL、0.0502μg/ mL、0.0503μg/mL、0.0503μg/mL、0.5093μg/mL、1.001μg/mL、1.004μg/mL、1.018μg/mL、0.503μg/ mL、0.050μg/mL、0.5006μg/mL、0.5001μg/mL的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、T-2、FB1、FB2、FB3、ZEN、OTA、OTB、DON混合标准溶液，并于-4℃条件下备用。

1.2色谱和质谱条件

色谱条件：采用Waters Atlantisd C18（150 mm×2.1 mm，1.7μm）为色谱柱。水（A）-甲醇（B）为流动相，梯度洗脱程序为：0～1.0 min，流动相B为15%；1.0～3.0 min，流动相B为15%～70%；3.0～5.1 min，流动相B为70%～ 90%；5.1～8.0 min，流动相B为90%；8.0～8.1 min，流动相B为90%～15%；8.1～10 min，流动相B为15%。柱温为25℃，流速为0.2 mL/min，进样量为5μL。

质谱条件：ESI扫描方式为正负离子扫描。离子源温度为300℃，毛细管温度为350℃；ESI+模式下毛细管电压为+4.0 kV，ESI-模式下毛细管电压为-2.0 kV；12种真菌毒素质谱优化参数见表1。

1.3样品的制备

称取样品固体粉末5 g，精密加入甲醇（体积分数为70%）溶液25 mL，超声处理30 min，离心5 min。精密量取上清液5 mL，加水稀释至20 mL。取3 mL混合液通过HLB柱，后用3 mL甲醇洗脱，在40℃氮气下缓慢吹至近干，用乙腈（体积分数为50%）溶液稀释至1 mL，过滤后进行测定。

2结果与分析

2.1线性关系、检测限（LOD）和定量限（LOQ）的考察

精密移取1.1项下的混合标准溶液适量，用乙腈（体积分数为50%）溶液稀释并定容，配制成系列梯度混合标液，以各目标物质量浓度对应的峰面积进行最小二乘线性回归绘制标准曲线，并根据斜率和平方相关系数（R2）对结果进行评价。此外，根据3倍信噪比（S/N=3）计算LOD，10倍信噪比（S/N=10）计算LOQ。12种真菌毒素的线性方程、相关系数、线性范围、检出限和定量限结果见表2。各真菌毒素在一定浓度范围内线性关系良好（R2>0.995）。各真菌毒素的LOD为0.1～3.8μg/kg，LOQ为0.3～8.5μg/kg。

2.2回收率实验

称取一定质量的空白样品木香，添加适量真菌毒素混合标准溶液，制成不同浓度水平的样品，计算方法的回收率（见表3）。12种真菌毒素的加标回收率范围为81.6%～100.5%，相对标准偏差（RSD）为6%～6.81%，说明方法回收率良好。

2.3方法的精密度

称取空白基质的样品各6份，加入混合标准溶液4.0 mL，制成精密度样品溶液进行测定。12种真菌毒素含量的RSD为0.3%～2.7%，表明精密度良好。

2.4样品溶液的稳定性

取空白基质加标供试品溶液1份，分别于0、4、8、12、16、20、24 h进行测定。12种真菌毒素含量的RSD为0.3%～2.1%，表明样品溶液在24 h内稳定。

2.5样品的测定

利用已建立的方法对三峡库区51批木香药材进行测定（检出的结果见表4），共检出阳性样品5份，检出率为9.8%。其中，FB2毒素的检出平均值最高，为12.05μg/kg，其次为T-2、FB1和ZEN，分别为5.83μg/ kg、1.58μg/kg和0.69μg/kg。检出率最高的真菌毒素是ZEN，为9.8%，其次为T-2和FB1，均为3.9%。综上，木香的真菌毒素污染情况值得关注，在关注毒性较强的四种黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的同时，仍然需要重点监督药材中伏马毒素B1、伏马毒素B2和T-2毒素这三种真菌毒素。