发酵饲料对刺参生长及其肠道、养殖水体菌群的影响

摘"要：为深入研究发酵饲料对刺参（Apostichopus japonicus）苗种培育的效应，试验对比了两种发酵饲料的差异，评估它们对刺参苗种生长速率与存活率的影响，并通过高通量测序分析了饲料对养殖池水和刺参肠道菌群结构的差异和关联。试验选取75 kg健康刺参苗种，分为未发酵饲料组（CT）、枯草芽孢杆菌发酵饲料组（BA）和布氏乳杆菌发酵饲料组（LAB），每组3个平行。结果显示，LAB组的特定生长率（4.14%±0.55%）最高，显著高于CT组（3.36%±0.42%）和BA组（3.8%±0.75%）；BA组存活率最高（79.7%±2.74%），显著高于LAB组（70.28%±1.11%）和CT组（72.42%±6.18%）。发酵饲料组的增重率和饲料系数优势明显。肠道菌群丰度和多样性显著高于水体（P＜0.05），LAB组和BA组的CHAO1指数、香农指数均高于CT组，发酵饲料增加了变形菌门和疣微菌门相对丰度。发酵饲料对肠道菌群有促进作用，提高了刺参的存活率和增重率，并增加了水体菌群丰度，对水体生态平衡有正面影响。

关键词：刺参（Apostichopus japonicus）；发酵饲料；生长；高通量测序；菌群

刺参（Apostichopus japonicus）属棘皮动物门（Echinodermata），海参纲（Holothuroidea），广泛养殖于我国的胶东半岛和河北、辽宁沿海地区^[1-2]。刺参是一种以沉积物为食的底栖生物，其肠道内细菌占有很高的比例。研究指出，细菌是刺参能量获取的重要来源，超过70%的能量需求依赖于细菌的贡献^[3]。因此，对刺参肠道及养殖环境菌群多样性的研究显得非常关键。刺参肠道的微生物生长依赖于其所处的养殖环境，而这些微生物群落也在刺参体内发挥着免疫和辅助消化的作用^[4]。当前，刺参饲料领域的研究焦点主要集中于饲料成分如何优化以促进刺参的生长发育^[5]，而针对刺参发酵饲料的深入探索尚处于初级阶段。姜燕等^[6]在养殖实践中观察到，采用发酵饲料进行投喂，能够显著提升刺参的养殖产量，为刺参饲料配方的创新开辟了新路径。本研究通过刺参发酵饲料为切入点，综合分析了其对刺参生长、肠道菌群及养殖水体菌群的影响，旨在为刺参养殖提供理论依据和参考数据。

发酵饲料技术是抗生素禁令下的畜禽饲料创新技术^[7]，目前看发酵饲料主要有以下优点：改良饲料品质^[8]，降低饵料系数^[9]，物质会被分解成微小的分子和容易被动物吸收的营养物质，这样一来，饲料就更容易被动物吸收和利用了^[10]。在发酵的过程中，微生物会产生大量消化酶和促生长因子，可以提高饲料的消化利用率^[11]。同时，发酵饲料可以降低饲料成本，饲料发酵之后通过益生菌的大量繁殖可以提高饲料的蛋白质含量^[12-13]此外，发酵饲料的投喂可以提高养殖动物的免疫力，增加养殖动物的抗病能力。目前已经有研究表明乳酸杆菌^[14]和芽孢杆菌^[15]可以产生细菌素，抑制病原菌的生长。

1"材料与方法

1.1"刺参苗种来源

本研究所使用的刺参来自辽东湾新区一家海水养殖场，选择了生长状况良好且摄食能量旺盛的健康刺参苗种，每头苗种的规格为（1.93±0.22）g，经过5 d的临时饲养后，进行相关的试验研究。

1.2"饲料的来源与制作

本试验所用饲料购于某水产饲料公司，饲料分三组，其中发酵组两组，其中一组基于未经发酵的饲料，加入了5%的葡萄糖和10%的布氏乳杆菌发酵液，并在30°C的温度下进行了2 d的恒温发酵，从而得到了布氏乳杆菌发酵饲料。另一组在未发酵饲料的基础上添加了5%的葡萄糖和10%的枯草芽孢杆菌发酵液，在30 ℃恒温条件下发酵2 d，制备成枯草芽孢杆菌发酵饲料。将饲料与海泥以1∶4的比例充分混合，随后加入足量海水并均匀搅拌，确保混合物细腻。之后，通过80目筛绢精细过滤，以去除杂质，最终得到的混合物即可进行投喂。

1.3"投喂发酵饲料对刺参生长的影响

在本次试验中，选用了9个容积达40 m³的刺参育苗池，随后在池中布设了波纹板，作为刺参幼苗的有效附着基质。每个育苗池中均投放12.5 kg刺参苗种。试验设置三组不同的处理方式：第一组投喂未经发酵的饲料（CT组），第二组投喂由枯草芽孢杆菌发酵的饲料（BA组），而第三组则投喂由布氏乳杆菌发酵的饲料（LAB组）。每组设三个平行的处理组。试验周期为40 d，每天投喂两次，投喂量为刺参体质量的2%，日换水1/2，每隔20 d进行一次倒池。

在养殖试验完成后，将所有的试验刺参取出，测量其总重量，并进行随机采样，以计算刺参的平均体质量和特定生长率（Specific growth rate，SGR）；基于总重和平均体质量来确定总数，并据此进一步估算其生存率（Survival rate，SR）。根据刺参增重和初始体质量的比值算出增重率（Weight gain rate，WGR）。根据刺参试验时间段内摄入的饲料总量和试验时间段内的体质量增加总量，计算饲料系数（Feed Conversion Ratio，FCR），SGR（%·d^-1）、SR（%）、WGR（%）、FCR计算公式如下：

SGR=（lnW_t–lnW₀）/t×100%；

SR=（N₀-N_t）/N₀×100%；

WGR=（W_t-W₀）/W₀×100%；

FCR=TFI/TWG。

式中，W₀和W_t分别为试验刺参的起始和结束时体质量，g；t为养殖的时间周期，d；N₀和N_t分别为试验中刺参的起始数量和结束数量，个；TFI为刺参在特定时间段内摄入的饲料总量，g；TWG为刺参在同一时间段内的体质量增加总量，g。

1.4"样品采集

选取健康刺参取出刺参肠道内容物，试验开始时取第一次样，20 d倒池时取第二次样，40 d试验结束时取第三次样。分别标记为投喂枯草芽孢杆菌发酵饲料组BA₁、BA₂、BA₃，投喂布氏乳杆菌发酵饲料组LAB₁、LAB₂、LAB₃和不投喂发酵饲料的空白对照组CT₁、CT₂、CT₃。

采集刺参养殖池水质样本4 L，运用玻璃采水器过滤处理，随后经0.22 μm孔径的无菌醋酸纤维素滤膜进行真空抽滤处理，旨在从样本中分离并提取细菌总DNA。样品分别标记为投喂枯草芽孢杆菌发酵饲料组W.BA₁、W.BA₂、W.BA₃，投喂布氏乳杆菌发酵饲料组W.LAB₁、W.LAB₂、W.LAB₃和不投喂发酵饲料的空白对照组W.CT₁、W.CT₂、W.CT₃。所有样本都在-80 ℃的超低温冰箱中冷冻储存。

1.5"DNA提取

从刺参肠道和养殖水体样本中，提取细菌的DNA，并参考相关文献中的提取方法^[16]。

1.6"PCR扩增与高通量测序

细菌16S rRNA基因V3—V4片段的扩增引物为343F（5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′）（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和798R（5′-AGGGTATCTAATCCT-3′），进行PCR扩增，送至诺禾致源（北京）股份有限公司进行高通量测序。

1.7"数据分析

采用Usearch软件执行OTUs（操作分类单元）的聚类分析，并确定了97%的相似度阈值。使用RDP-classifier软件执行物种的分类，其中分类的阈值被设定为0.8，低于这个阈值的物种将被分类为未分类（Unclassified）。采用SPSS 17.0统计软件，对试验收集的数据进行单因素方差分析（One-way ANOVA），进一步借助Tukey事后检验，以细致探究不同组别间的差异层次。显著性水平为P＜0.05。

2"试验结果

2.1"投喂发酵饲料对刺参特定生长率、存活率、增重率以及饲料系数的影响

根据表1的数据，LAB组的SGR值为（4.14±0.55）%/d，这一数值稍微超过了BA组，并且也明显高于CT组（P＜0.05）；然而，从SR的角度分析，BA组的数值为（79.7±2.74）%，显著高于CT组（72.42±6.18）%（P＜0.05）；从WGR来看，LAB组的增重率最高，为（68.83±1.04）%，BA组次之，CT组最低，为（55.33±2.52）%，差异显著；饲料系数对比来看，LAB组最低，BA组次之，CT组最高。

2.2"高通量测序结果

利用高通量测序技术，我们对刺参肠道和养殖水体的18个样本进行了检测，得到了80 512～103 358条有效序列。这些有效序列的百分比均超过了79.81%，覆盖率也高达96.42%，这证明测序的结果能够真实地展现样本的信息。

2.3"菌群多样性

2.3.1"刺参肠道和养殖水体菌群多样性分析

18个样品中ACE和Chao1多样性指数分别是刺参肠道样品600.049～774.513和471.286～770.943，水体样品302.333～397.065和335.364～397.065；Shannon和Simpson指数分别是刺参肠道样品4.970～6.117和0.866～0.963，水体样品3.254～4.663和0.654～0.896。不同饲料养殖的刺参，其肠道与养殖水体中的菌群构成在数量及多样性方面均呈现出显著差异（P＜0.05）。具体而言，等级分布曲线（rank abundance）能同时反映样品中细菌的丰富度和均匀度。曲线在横轴上的长度代表物种丰富度，长度越长，物种越丰富；曲线的平坦程度反映物种均匀度，曲线越平，均匀度越高。图1（封三）显示，刺参肠道细菌多样性高于水体样品，且肠道中有明显优势的细菌种类。

2.3.2"发酵饲料对刺参肠道和水体菌群的影响

基于OTUs的聚类分析数据，从样本中筛选出了有效的OTUs，并对比了刺参肠道与养殖水体样本之间的区别。从图2（见封三）可以观察到，在CT组中，刺参肠道和养殖水体样本共享了47个OTUs，其中刺参肠道样本中只有424个OTUs，而养殖水体样本中只有295个OTUs。在BA组中，发酵饲料组的刺参肠道和养殖水体样本共享了41个OTUs，在刺参的肠道样本中，存在576个独特的OTUs，而在养殖的水体样本中，则有309个独特的OTUs。在LAB组样本中，刺参肠道和养殖水体样本共同存在50个OTUs，在刺参肠道样本中，有618个OTUs是独特的，而在养殖水体样本中则有309个独特的OTUs。

以样本中的OTUs绘制了Venn图（韦恩图）。由图3（封三）可知，LAB组独有的OTUs为376个，BA组独有的OTUs为338个，CT组独有的OTUs为225个，3组共同拥有的OTUs为163个。水体样品中W.LAB组独有的OTUs为191个，W.BA组独有的OTUs为121个，W.CT组独有的OTUs为119个，3组共同拥有的OTUs为124个。

2.3.3"基于门水平上的菌群结构与聚类分析

根据菌群结构分析，不同饲料投喂组别9个肠道样品中检测到的细菌归属于89个门类，32 704个属，肠道样本中变形菌门（Proteobacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobiae）、拟杆菌门（Bacteroidota）、放线菌门（Actinobacteria）、蓝菌门（cyanobacteria）、厚壁菌门（firmicutes）是主要优势菌门，和CT组相比LAB组和BA组变形菌门相对丰度降低，疣微菌门相对丰度提高，LAB组菌群丰度最高。

养殖水体菌群结构分析中，不同饲料投喂组别9个养殖水体样品中检测到的水体样本细菌归属于79个门类，13 013个属，水体样本中变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidota）、放线菌门（Actinobacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobiae）、蛭弧菌门（bdellovibrionota）、纳古菌门（nanoarchaeota）等是主要优势菌门，和W.CT组相比W.LAB和W.BA组变形菌门相对丰度降低，拟杆菌门相对丰度升高。

2.3.4"测序肠道及水体样本中优势微生物基于属水平的系统分类

在属水平上各组肠道菌群中的优势菌属主要是沈氏菌属（Shimia）、桃色杆菌属（Persicirhabdus）、鲁杰氏菌（Ruegeria）、拉布伦茨氏菌属（Labrenzia）、盐杆条菌属（Haloferula）、洛克氏菌属（Halocynthiibacter）等。与CT组相比LAB组和BA组沈氏菌属相对丰度降低，LAB组菌群多样性最丰富。

水体各组的优势菌属为弧菌属（Vibrio）、海生杆菌属（Marivita）、海小杆菌属（Marinobacterium）、棕囊藻杆菌属（Phaeocystidibacter）、异冰居菌属（Glaciecola）等，随着投喂时间加长各组弧菌属（Vibrio）的相对丰度都在降低，其中W.LAB组相对丰度最低。

3"讨论

3.1"投喂刺参发酵饲料会影响其特定的生长速度、生存率、质量提升速度及饲料系数

发酵饲料过程中产生的微生物酶可以分解饲料中的复杂成分，从而提高饲料的消化率，使养殖动物能更好地吸收利用营养，有助于养殖生物的成长^[17]。通过对比投喂发酵饲料对刺参特定生长率、存活率、增重率和饲料系数的影响看出，LAB组的刺参特定生长率显著高于CT组，BA组的刺参存活率显著高于CT组。通过对比，投喂发酵饲料组的增重率提高了，同时饲料系数也降低了。李利华^[18]的试验发现，发酵饲料显著促进刺参生长及存活，其效果远超常规饲料。本试验的结论紧密契合前期研究揭示的发酵饲料对刺参存活率的正向作用，再度巩固了发酵饲料在刺参养殖业中的优势地位。

3.2"发酵饲料对刺参肠道菌群和水环境的影响

3.2.1"投喂发酵饲料对刺参肠道和养殖水体菌群多样性影响分析

肠道菌群通过营养代谢、免疫调节、维持肠道屏障和影响神经系统，与宿主形成共生关系，平衡时促进健康生长，失衡可导致多种疾病。本研究表明，LAB组和BA组显著提高了肠道菌群和养殖水体的OTUs数目和特有OTUs数目；与CT组相比，LAB组和BA组Chao1指数、香农指数提高，Chao1指数、香农指数分别与菌群丰度和物种多样性呈正相关，这表明发酵饲料对刺参肠道菌群有一定的促进作用，这可能与发酵饲料中益生菌在刺参肠道定植有关。

在养殖水体中W.LAB组的Chao1指数和ACE指数均高于BA组和CT组，Chao1指数和ACE指数与菌群丰度呈正相关，说明布氏乳杆菌发酵饲料增加了水体菌群丰度，反应了对水体生态系统的正面影响，有助于维持或恢复水体的生态平衡和健康状态。

3.2.2"基于门水平刺参肠道与环境之间的菌群结构关系

依据样本中的菌群构成以及聚类分析的结果来进行研究，刺参肠道与养殖水体中，变形菌门占据核心地位，构成刺参养殖生态系统内最为庞大的细菌群体。此菌门在刺参所处的自然环境中，对核心的碳氮循环环节展现出不可或缺且决定性的功能^[19]。该结论与海洋细菌领域的广泛研究成果相契合，进一步强化了先前发现的有效性与可靠性^[20]。在次优势菌群中除了BA₁组的次优势菌群为放线菌门，其余各养殖组的次优势菌门均为疣微菌门。在养殖池塘水系中，海洋放线菌彰显卓越大分子降解力，涵盖淀粉与蛋白质，助力海洋生态物质循环。同时，该类微生物能合成高效抗菌物质，为天然抗菌剂研发提供重要资源。更值得一提的是，海洋放线菌独具耐热耐干孢子生成能力，这些特性赋予其在极端环境中生存并发挥作用的能力，从而极大地扩展了其应用前景与生态重要性，因此具有成为益生菌的巨大潜力^[21]。疣微菌门内的微生物在水生生态环境中有着广泛的分布，并在生物地球的氮循环过程中发挥着至关重要的角色^[22]。拟杆菌门为海洋浮游细菌体系的核心分支，位居次优势群落，其成员菌种凭借胞外水解酶合成，展现对几丁质等生物大分子的分解能力^[23]。此外，拟杆菌门经常与脂质、蛋白质等有机物质的代谢和转化密切相关，这些有机物质在水体的碳循环中起到了关键的作用^[24]。

本试验还发现LAB组和BA组对比CT组变形菌门相对丰度降低，疣微菌门相对丰度提高。CT组相比LAB组和BA组肠道菌群在门水平上的组成结构也发生了一定的变化，这可能与发酵饲料能够缓解肠道刺激、改善肠道环境有关。和W.CT组相比，W.LAB和W.BA组变形菌门相对丰度降低，拟杆菌门相对丰度升高。说明投喂发酵饲料对养殖水体菌群门水平的组成结构也有一定的影响。

LAB组的菌群结构较丰富，与之相对应的是该组的刺参特定增长率和增重率最高。各组的肠道样品中只有BA组的次优势菌门为放线菌门，同时在各养殖组中BA组刺参存活率最高，结合菌群功能分析推断放线菌门可能起到了一定的作用。

3.2.3"基于属水平刺参肠道与环境之间的菌群结构关系

聚类结果分析，刺参肠道菌群结构和水体菌群结构相关性较低。这与刺参底栖并以沉积物为食的习性有关，与前人研究结果一致^[25]。在试验开始时各组水体样品菌群中优势菌属均为弧菌属（Vibrio），在养殖试验结束时各组优势菌属均为海小杆菌属（Marinobacterium）。海小杆菌属广泛分布于海洋环境中，该菌属多为好氧、啫盐性微生物，可以在各种温度和盐度的海洋环境中广泛生存^[26]。和刺参肠道菌属相对比，养殖水体优势菌属随养殖周期变化更大。

刺参肠道优势菌属为沈氏菌属（Shimia）、拉布伦茨氏菌属（Labrenzia）、棕囊藻杆菌属（Phaeocysti-dibacter）。沈氏菌属（Shimia）、拉布伦茨氏菌属（Labrenzia），都属于变形菌门（Proteobacteria）的细菌，广泛分布于海洋环境中，特别是在海水和海底沉积物中。这使得它们在海洋生态系统的碳循环中扮演重要角色，有助于维持生态平衡。拉布伦茨氏菌属（Labrenzia）的某些细菌具有氧化硫化物的能力，这些细菌能够将硫化物氧化为硫酸盐，从而在硫循环中发挥作用，有助于减少环境中的硫污染^[27]。拉布伦茨氏菌属（Labrenzia）在本试验中为养殖中后期的优势菌属，且两种发酵饲料组中的该菌属丰度高于未发酵饲料组，结合生长存活数据发酵组高于未发酵组，推测发酵饲料在处理硫化氢等水产养殖有害物质时强于未发酵饲料。棕囊藻杆菌属（Phaeocystidibacter）属于变形菌门伶俐杆菌科，棕囊藻是一种广泛分布于海洋中的微藻，因此棕囊藻杆菌属的细菌可能与这些藻类存在共生或互利关系。刺参饲料中含有大量藻类，推测该优势菌属和投喂饲料有一定关联。

4"结论

和不发酵饲料相比，发酵饲料对刺参中间培育过程中的生长和存活率都有一定的影响，投喂布氏乳杆菌发酵饲料可以显著提高刺参养殖过程中的产量，投喂枯草芽孢杆菌发酵饲料可以提高刺参的存活率。刺参肠道与其周围环境的主导菌群存在某种联系，但同时也展现出其独有的结构和属性。本研究选用两种不同菌种发酵饲料探究发酵饲料对刺参生长和菌群产生的影响，希望对刺参的绿色养殖给出理论参考。

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Effects of fermented feed on the growth of Apostichopus japonicus and its intestinal and water microbial communities

LIU Jingwen，WEI Yinghua，WANG Hanlin

（Key Laboratory of Mariculture amp; Stock Enhancement in North China's Sea，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，College of Fisheries and Life Science，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China ）

Abstract：

To investigate the effects of fermented feed on the cultivation of juvenile sea cucumbers （Apostichopus japonicus）， the impact of two types of fermented feed were examined on the growth and survival of juvenile sea cucumbers.High-throughput sequencing was used to analyze the differences and correlations in the microbial community structure between the culture water and the intestines of the sea cucumbers. 75 kg healthy juvenile sea cucumbers were selected and divided into three groups：the unfermented feed group （CT），the Bacillus subtilis fermented feed group （BA），and the Lactobacillus buchneri fermented feed group （LAB），with three replicates for each group.The results showed that the specific growth rate （SGR） was the highest in the LAB group （4.14%±0.55%），significantly higher than that in the CT group （3.36%±0.42%） and the BA group （3.8%±0.75%）.The survival rate was the highest in the BA group （79.7%±2.74%），significantly higher than that in the LAB group （70.28%±1.11%） and the CT group （72.42%±6.18%）.The fermented feed groups also exhibited significant advantages in terms of weight gain rate and feed conversion ratio.The intestinal microbial community's abundance and diversity were significantly higher than those in the water （p＜0.05）.The Chao1 and Shannon indices in the LAB and BA groups were higher than those in the CT group.Fermented feed increased the relative abundance of the phylum Proteobacteria and enhanced the relative abundance of the phylum Verrucomicrobia.Fermented feed positively influenced the intestinal microbiota，improving the survival rate and weight gain rate of the sea cucumbers，and increased the microbial abundance in the water，contributing to ecological balance in the aquatic environment.

Key words：Apostichopus japonicus;fermented feed;growth; high-throughput sequencing;microbial community

（收稿日期：2024-10-21）