SPE-UHPLC-MS/MS法在猪肉氯苯胺灵残留检测中的应用

摘 要：本研究采用固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法（Solid Phase Extraction-Ultra High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，SPE-UHPLC-MS/MS）对猪肉中氯苯胺灵的残留进行检测。通过优化气相色谱-质谱条件，建立了氯苯胺灵的标准曲线，结果表明，氯苯胺灵在0.50～100.00 μg·L-1线性关系良好，相关系数为0.996 4。平均加标回收率为85.25%～92.75%，相对标准偏差为1.83%～3.07%。该方法回收率好、精密度高，适用于猪肉中氯苯胺灵的快速、准确检测。

关键词：固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法；猪肉；氯苯胺灵

Application of SPE-UHPLC-MS/MS in the Determination of Chlorpheniramine Residues in Pork

WANG Dan

（Qin’an County Food and Drug Inspection and Testing Centre， Qin’an 741600， China）

Abstract： This study used solid phase extraction ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry （SPE-UPLC-MS/MS） to detect residues of chlorpheniramine in pork. By optimizing the gas chromatography-mass spectrometry conditions， a standard curve for chlorpheniramine was established. The results showed that chlorpheniramine had a good linear relationship between 0.50 μg·L-1 and 100.00 μg·L-1， with a correlation coefficient of 0.996 4. The average recovery rate of spiked samples is 85.25% to 92.75%， and the relative standard deviation is 1.83%～3.07%. This method has good recovery rate and high precision， and is suitable for rapid and accurate detection of chlorpheniramine in pork.

Keywords： solid phase extraction-ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; pork; chlorpheniramine

氯苯胺灵是一种广泛应用于兽医领域的抗组胺药物，主要用于治疗动物的过敏性疾病。然而，由于其在动物体内的残留对人体健康构成潜在风险，特别是在食品安全日益受到重视的背景下，监测食品中药物残留成为重要的研究课题。猪肉作为人们日常饮食中常见的肉类食品，其安全性直接影响到消费者的健康[1-2]。在国际上，为了检测氯苯胺灵及其他兽药残留，已经开发并应用了多种分析方法。传统的检测技术，如气相色谱和液相色谱，虽然具有一定灵敏度和选择性，但在处理复杂样品基质时往往面临干扰问题。近年来，随着质谱技术的发展，液相色谱-质谱联用和超高效液相色谱-质谱联用逐渐成为兽药残留检测分析的主流技术。这些技术不仅提高了检测的灵敏度，还有效减少了基质效应[3-4]。在国内，针对氯苯胺灵的研究相对较少，但随着食品安全法规的不断完善和消费者对食品安全意识的提高，相关研究正在逐渐增加。研究人员开始关注使用固相萃取与高效液相色谱-质谱联用技术（Ultra High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry，UHPLC-MS/MS）相结合的方法，优化样品前处理和分析条件，以提高氯苯胺灵的检测效率和准确性。因此，开发出高效、灵敏的检测方法，确保猪肉中氯苯胺灵的残留水平符合食品安全标准，具有重要的实际意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪肉，购自超市；氯苯胺灵标准溶液（1 000 mg·L-1），上海绩祥生物科技有限公司；无水氯化钠（分析纯），四川源盛达化工有限公司；甲酸、甲醇、乙腈、氯化钠和正己烷（色谱纯），均购自美国Merck公司；乙腈标准溶液，美国Merck公司。

1.2 仪器与设备

AB SCIEX QTRAP 5500+型超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱联用仪，美国Agilent公司；HES-24B真空固相萃取装置，美国Agilent公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液配制

①氯苯胺灵标准储备液：精确吸取1.0 mL氯苯胺灵标准溶液（1 000 mg·L-1），用甲醇稀释后定容至25 mL容量瓶中，即得氯苯胺灵标准储备液（40 mg·L-1）。②氯苯胺灵标准溶液：精密量取1.0 mL氯苯胺灵标准储备液，用甲醇稀释，配置成1.0 mg·L-1氯苯胺灵标准溶液。③氯苯胺灵标准系列溶液：分别吸取12.50 μL、25.00 μL、56.25 μL、112.50 μL、225.00 μL、1 125.00 μL和2 500.00 μL氯苯胺灵标准储备液，用甲醇稀释至1 L，即得0.50 μg·L-1、1.00 μg·L-1、2.25 μg·L-1、4.50 μg·L-1、9.00 μg·L-1、45.00 μg·L-1和100.00 μg·L-1标准溶液。

1.3.2 样品前处理

样品粉碎→试样（3 g试样放入50 mL离心管）+10.0 mL乙腈→超声提取5 min→均质15 min→2 g氯化钠+3 g无水氯化钠→均质3 min，10 000 r·min-1，离心3 min→取上清液7 mL→2 mL正己烷（乙腈饱和）（均质2 min，10 000 r·min-1，离心2 min）→取提取液5 mL→45 ℃氮吹→定容→待测。

甲醇5 mL+水5 mL→活化固相萃取柱→乙腈水溶液（5 mL，30%）→乙腈8 mL洗脱→45 ℃氮吹，浓缩至0.5 mL→乙腈-0.2%甲酸水（V/V）溶液（1∶1，V/V）→过0.22 μm PTFE滤膜→待测。

1.3.3 气相色谱-质谱条件

（1）色谱条件。流动相A：0.2%甲酸水溶液；流动相B：乙腈；洗脱顺序：B（15%，0～1.00 min）→B（15%→ 90%，1.00～5.00 min）→B（90%，5.00～8.00 min）→B（90%→ 15%，8.00～8.01 min）→B（15%，8.01～10.00 min）；进样量：5 μL；柱温：40 ℃。

（2）质谱条件。ESI模式；离子源温度：550 ℃；扫描模式：正离子扫描模式。

1.3.4 标准曲线绘制

按照1.3.3气相色谱-质谱条件，将氯苯胺灵标准溶液（1 000 mg·L-1）、标准系列溶液（0.50 μg·L-1、1.00 μg·L-1、2.25 μg·L-1、4.50 μg·L-1、9.00 μg·L-1、45.00 μg·L-1、100.00 μg·L-1）依次进行上机测定，以氯苯胺灵的峰面积为纵坐标（y），质量浓度为横坐标（x），进行线性回归，绘制标准曲线[5]。

1.3.5 回收率与精密度

在1.3.3气相色谱-质谱条件下，准备5 g（精确至0.01 g）空白样品，向空白样品中添加0.003 mg·kg-1、0.006 mg·kg-1、0.060 mg·kg-1标准溶液，按照1.3.2进行样品前处理，平行测定6次，计算加标回收率和精密度。

2 结果与分析

2.1 色谱柱的选择

将过滤后的样品提取液注入高效液相色谱仪，记录注入量。根据Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm×2.1 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX SB-C18（100 mm×2.1 mm，5 μm）、Agilent Eclipse Plus C18（150 mm×2.1 mm，5 μm）色谱柱的特性，选择适当的检测波长进行监测。记录保留时间、峰面积和峰形状等关键参数。Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm×2.1 mm，5 μm）色谱柱的保留时间和峰形效果均优于其他两种色谱柱。因此，被选为氯苯胺灵的分离色谱柱。

2.2 固相萃取柱的选择

不同类型的固相萃取（Solid Phase Extraction，SPE）柱在样品净化方面的效果存在差异。本研究对4种SPE柱进行了比较，包括阳离子交换SPE柱ProElut PXC（60 mg/3 mL）、阴离子交换SPE柱ProElut PXA（60 mg/3 mL）、硅酸镁SPE柱ProElut Florisil（200 mg/3 mL）以及亲水亲脂平衡SPE柱ProElut PLS（200 mg/6 mL），以评估它们对氯苯胺灵的保留能力。由图1可知，亲水亲脂平衡SPE柱的保留量最高，达到98.3%。这表明亲水亲脂平衡SPE柱在样品净化过程中对氯苯胺灵具有较高的亲和力，能够有效地捕获目标化合物。这种高保留量与其特殊的填料特性有关，该填料使其在极性和非极性分子之间实现良好的平衡。阳离子交换SPE柱和阴离子交换SPE柱的保留量分别为88.7%和85.3%。这两种柱虽然表现不及亲水亲脂平衡SPE柱，但仍然具有较高的保留能力，适合在一定条件下进行氯苯胺灵的净化。这与它们的填料成分和孔隙结构有关。硅酸镁SPE柱的保留量最低，仅为60.2%。这表明其在净化氯苯胺灵时效果较差，是由于其对该类化合物的亲和力不足。硅酸镁SPE柱通常用于分离极性较强的化合物，因此在处理氯苯胺灵时面临一定的挑战。因此，本实验选择亲水亲脂平衡SPE柱作为固相萃取柱。

2.3 标准曲线、相关系数及检出限

在实验中，将氯苯胺灵质量浓度作为横坐标，以氯苯胺灵峰面积作为纵坐标，绘制出标准曲线。得到标准曲线的方程为Y=3 004.096 8X+517.960 8。标准曲线的相关系数r2为0.996 4，接近于1，检出限为2.5 µg·L-1，表明质量浓度与峰面积之间存在良好的线性关系。

2.4 回收率与精密度

在不同添加水平（0.003 mg·kg-1、0.006 mg·kg-1和0.060 mg·kg-1）下测定氯苯胺灵的加标回收率和相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）。每个添加水平进行6次平行试验。由表1可知，氯苯胺灵的平均回收率为85.25%～92.75%，相对标准偏差为1.83%～3.07%，表明本实验所开发的SPE-UHPLC-MS/MS法在不同浓度下均能有效检测氯苯胺灵残留，且具有较高的准确性和精密度。随着添加水平的提高，回收率和精密度均有所改善，尤其是在0.060 mg·kg-1浓度水平下，表现出最佳的检测性能。

2.5 实际样品检测

采用本文建立的方法对6个超市的60批次猪肉样品进行全面的检测。检测结果显示，所有样品均未检测出氯苯胺灵残留。这一结果不仅表明了本研究方法的有效性和可靠性，也反映出这些超市销售的猪肉产品在氯苯胺灵方面符合相关安全标准。通过对这些样品的检测，验证了该方法实际应用在猪肉样品检测中的可行性。

3 结论

本研究成功开发了固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法，能够有效检测猪肉中氯苯胺灵残留，具有良好的分析性能。通过对氯苯胺灵标准溶液进行测定并绘制标准曲线，结果表明，氯苯胺灵的质量浓度与峰面积之间存在良好的线性关系，相关系数r²为0.996 4，确保了定量分析的可靠性。氯苯胺灵的加标回收率为85.25%～92.75%，相对标准偏差为1.83%～3.07%，表明该方法在样品前处理和分析过程中的准确性和精密度均较高。SPE-UHPLC-MS/MS法具有快速、灵敏和准确的特点，适用于猪肉及其他动物源性食品中氯苯胺灵的检测，能够为食品安全监管提供有效的技术支持。

参考文献

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