石灰与绿肥对连作雪茄烟田土壤理化性质与真菌群落的影响

关键词： 石灰； 绿肥； 连作； 雪茄烟； 真菌； 群落结构； 功能类群

土壤中真菌作为土壤微生物中重要的成员，在有机质分解、物质和能量转化中发挥着重要的作用[1]。土壤真菌群落多样性与群落结构受土壤温湿度、pH 等环境因子变化的影响而极易发生改变。近几十年，为提高作物产量，减少病虫害的发生，农业生态系统中投入大量的化肥与农药，对土壤质量和生态环境产生较大的负面影响，而农作物连作种植模式下农田更需要不间断地施用各种肥料与农药，加剧了其负面效应。长期施用化肥在造成土壤酸化、板结等问题的同时，还会降低微生物多样性、影响微生物群落结构[2−3]。而化学农药的施用虽然有效减少了病虫害的发生，但大量农药残留在土壤生态环境中，降低了土壤有益微生物的丰度[4] 。有研究表明，施用生物质炭、石灰、有机肥、微生物菌剂等措施[5−7]可改善土壤微生物群落结构，起到改良土壤的目的。其中绿肥还田可提高土壤有机质及土壤微生物量[8−10]。石灰还田可在短时间有效提高土壤pH，缓解土壤酸化现象，降低酸化对土壤根际微生物群落的危害[11]。因此施用石灰与绿肥还田均可从不同方面改良土壤，但二者对真菌群落的影响还有待进一步研究。本试验以连作雪茄烟田为研究对象，比较了施石灰、施石灰+绿肥还田、绿肥还田3 种土壤改良措施对土壤理化性状与不同微生物区系生物数量的影响，并借助Illumina NovaSeq 高通量测序技术和FUNGuild 平台分析了3 种改良措施对真菌群落多样性、组成结构、营养型组成及功能类群的影响，同时对相应土壤改良措施下雪茄烟的经济效益进行对比分析，旨在为改善连作烟田土壤微生态环境，提高土壤肥力，增加雪茄烟生产经济效益提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验地点和材料

试验于2021—2022 年在湖北省恩施土家族苗族自治州来凤县绿水镇进行。试验地平均海拔约500 m，雪茄烟连作年限达12 年，土壤较为板结，酸化现象较为严重，肥力有所下降，病害发生率呈上升趋势，烟叶产量较低。土壤pH 4.45，碱解氮 91.7 mg/kg，速效磷 70.3 mg/kg，速效钾 244.3 mg/kg，有机质18.9 g/kg，全氮 1.3 g/kg。试验雪茄烟品种CX80 为当地主栽品种之一，还田所用石灰为当地市售生石灰，其主要成分为CaO。绿肥品种为光叶紫花苕子。

1.2 试验设计

采用随机区组实验设计，研究石灰、绿肥还田两种措施，共设置4 个处理，分别为：1） 对照 （CK），即不施石灰、不种植绿肥；2） 施石灰（L），石灰用量为1500 kg/hm2，施肥前均匀撒施于小区地表后翻耕；3） 绿肥还田（GM），在上一年雪茄烟采收结束（2021 年10 月） 后，均匀撒播绿肥种子37.5 kg/hm2，于次年开春将生长的绿肥就地全量还田；4） 施石灰+绿肥还田（LGM），石灰施用量、绿肥播种量及相应处理方式分别同L 处理与GM 处理。各处理石灰与绿肥还田时间均设置在烟苗移栽前40 天（2022 年3 月） 完成，烟苗移栽时间均为4 月28 日。每个处理3 次重复，60 株雪茄烟为1 个小区（面积18.48 m2），株行距0.40 m×1.10 m。各小区以复合肥、有机肥、过磷酸钙作为基肥，硝铵磷肥、硫酸钾作为追肥，且氮磷钾肥料施用总量、施用时间、施用方式均相同，施肥比例N∶P2O5∶K2O=1∶0.9∶2.5，其他按照当地优质雪茄烟生产技术规范统一管理。

1.3 样品采集

在2022 年雪茄烟收获后，按不同处理小区采集耕作层0—20 cm 土壤混合样品。采集方法为每小区5 个采样点，每个采样点先用铁锹铲去表层约3 cm深的土壤，再采集同等质量的耕作层土壤，均匀混合为1 个样本。去除植物根系等杂质后用于后续土壤理化性状、微生物量测定及测序分析。

1.4 基因组DNA 的提取、PCR 扩增及测序

使用 Fast DNA Spin Kit for Soil DNA 提取试剂盒（MP Bio-medicals， 美国） 提取样品中的总 DNA，具体提取方法参照试剂盒说明书。再利用 1% 琼脂糖凝胶电泳（DDY-6C，北京市六一仪器厂，中国） 检测 DNA 提取质量，NanoDrop 2000 （Thermo FisherScientific，美国） 检测DNA 浓度和纯度。取适量的样本DNA 于离心管中，使用无菌水稀释样本至1 ng/μL。以稀释后的基因组 DNA 为模板，使用引物ITS5-1737F （5'−GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG−3'） 和ITS2-2043R （5'−GCTGCGTTCTTCATCGATGC−3'） 对样品的ITS1 可变区进行PCR 扩增。扩增程序：95℃ 预变性 1 min；98℃ 变性10 s，50℃退火 30 s，72℃ 延伸 30 s，30 个循环；72℃ 稳定延伸5 min。PCR 反应总体系为30 μL：2× Phusion MasterMix with GC Buffer 15 μL，上下游引物（2 μmol/L） 各2 μL，gDNA （1 ng/μL） 10 μL，用无菌水补足至 30 μL。将合格的扩增产物送至北京诺禾致源生物信息科技有限公司，使用 NovaSeq 6000 （Illumina，美国） 进行上机测序。

测序数据经质控处理后，采用U p a r s e 算法（Uparse，Version 7.0.1001） 对样本的全部有效数据进行聚类，默认以97% 的一致性（identity） 将序列聚类成为OTUs （operational taxonomic units）。使用QIIME 软件（Version 1.9.1） 将OTUs 代表序列与Unite 数据库（Version 8.2） 进行比对，得到各样本在真菌各个分类水平的物种注释。使用QIIME 软件（Version 1.9.1） 计算 OTUs、Chao1、Shannon、Simpson、ace、Goods-coverage、PD_whole_tree 指数。使用R 软件（Version 2.15.3） 绘制PCoA 分析图。使用LEfSe （LDA Effect Size） 分析工具进行LEfSe 分析（LDA≥4.0）。使用 FUNGuild 软件 （Version 1.0） 对OTUs 进行功能预测。

1.5 土壤微生物数量、理化性状测定

微生物数量采用稀释平板计数法[12]测定，细菌、真菌、放线菌培养基分别用牛肉膏蛋白胨琼脂、PDA和改良高氏 1 号琼脂培养基。土壤微生物总量计为细菌、真菌、放线菌三者数量之和。土壤pH、碱解氮、速效钾、速效磷、有机质、全氮参照鲍士旦[13]的方法测定。

1.6 雪茄烟经济性状测定

以小区为单位挂牌采收和晾制，晾制结束后统计各小区雪茄烟产量，并根据湖北省恩施州2022 年雪茄烟收购标准测算均价与产值。

1.7 数据处理与统计分析

利用 Microsoft Excel 2007 软件对基本数据进行整理并绘图，使用SPSS 22.0 软件开展方差分析，并在0.05 水平下采用Duncan’s 新复极差法检验处理间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 土壤基本理化性质分析

表1 显示，3 种土壤改良措施均可不同程度地提高土壤pH 值，但仅L 和LGM处理显著高于CK 处理。除L 处理外，LGM 和GM处理全氮、有机质、速效钾均显著高于CK 处理，以LGM 处理全氮、有机质含量最高，且均显著高于L 处理。3 种土壤改良措施均可显著提高土壤碱解氮含量，但各处理之间差异不显著。各处理间有效磷均无显著差异。说明施用石灰的处理均可显著提高土壤pH 值，改善土壤酸化现状，而种植绿肥并进行了翻压的处理则可显著提高土壤全氮、有机质及速效钾等养分含量，且以施用石灰与翻压绿肥相结合的效果更佳。

2.2 土壤微生物区系及数量分析

3 种土壤改良措施对土壤不同微生物区系及数量的影响差异显著（表2）。L、LGM 和GM 处理均可显著增加土壤中细菌数量，相比CK 处理分别增加23.22%、68.07%、46.70%，各处理间差异均达到显著水平。不同于细菌，L 和LGM 处理不同程度降低了土壤中真菌数量，且L 处理中真菌数量显著低于CK 处理，GM 处理则显著增加了土壤中真菌数量，相比CK 处理增加12.25%。相比CK 处理，L、LGM和GM 处理均可不同程度显著增加土壤中放线菌数量，分别增加16.87%、21.19%、10.91%。与细菌相同，L、LGM 和GM 处理均显著增加土壤中微生物总量，比CK 处理分别增加22.06%、62.12%、42.42%，且处理间均存在显著差异。说明施用石灰与翻压绿肥均可增加土壤中细菌、放线菌及微生物总量，且以两者结合效果最好。施用石灰能有效降低土壤中真菌数量，与翻压绿肥作用相反。

2.3 真菌群落多样性比较分析

在97% 相似水平下，各处理土壤样品真菌OTU丰度和 Alpha 多样性指数见表3。测序深度指数（Goods_coverage） 越接近于1，说明测序深度已经基本覆盖到样本中所有的物种。各样本测序深度指数均在0.994～0.995，说明测序结果合理。

LGM 和GM 处理的OTU 数均高于CK 处理，但仅GM 与CK 处理之间差异达到显著水平，高出CK处理15.01%。Shannon 和Simpson 指数为微生物群落多样性指数，Shannon 指数值越大群落多样性越高，Simpson 值越大群落多样性越低。Shannon 和Simpson指数在各处理之间无显著差异。Chao1 和ACE 指数反映样本真菌群落丰富度，指数值越大丰富度越高。4 个处理的ACE 指数之间均无显著差异，Chao1指数仅GM 处理显著高于CK 处理，说明绿肥还田能显著增加真菌群落丰富度。谱系多样性指数（PD_whole_tree） 反映群落内物种的亲缘关系，指数值越大说明物种谱系演化差异越大。GM 和LGM 处理谱系多样性指数显著高于CK 处理，说明绿肥还田与施石灰+绿肥还田处理能显著影响土壤中真菌群落的亲缘关系，但施石灰的影响不显著。

2.4 真菌群落主坐标（PCoA） 分析

基于 Weight Unifrac 距离矩阵，在OTU 水平下进行 PCoA （主坐标） 分析（图1）。其中，PC1 代表能最大程度区分所有样本的第一主坐标轴，可以解释样本中所有差异的 74.67%；PC2 代表能最大区分所有样本的第二主坐标轴，可以解释样本中所有差异的 6.57%。如果样本的群落组成越相似，则它们在PCoA 图中的距离越接近。由图1 可知，各处理的子样本均与CK 处理的子样本有较大的距离，同一处理的子样本之间表现出明显的组内聚集，表明同一处理的真菌群落结构相似性较高。L 处理与CK 处理样本之间距离较近，LGM、GM 处理均与CK 处理样本之间距离相对较远。说明绿肥还田与施石灰+绿肥还田处理对土壤中真菌群落结构的影响较大，施石灰的影响相对较小。

2.5 不同处理真菌门、属水平群落结构的组成及显著差异真菌种群分布

由物种注释分析结果生成各处理土壤真菌在门、属水平上的物种相对丰度堆积图（图2）。由图2 可知，子囊菌门（Ascomycota）、被孢霉门（Mortierellomycota）、毛霉门（Mucoromycota）、担子菌门（Basidiomycota）、罗兹菌门（Rozellomycota）、壶菌门（Chytridiomycota）、球囊菌门（Glomeromycota）、捕虫霉门（Zoopagomycota）、单毛壶菌门（Monoblepharomycota）、Aphelidiomycota为各处理中土壤真菌 TOP 10 的菌门。其中子囊菌门（Ascomycota）、被孢霉门（Mortierellomycota）、毛霉门（Mucoromycota）、担子菌门（Basidiomycota）、罗兹菌门（Rozellomycota） 为土壤中的优势菌门，其相对丰度之和占到了各组总测序丰度的67.87%～84.74%。相比CK 处理，L、LGM 和GM 3 个处理均不同程度地增加了子囊菌门（Ascomycota）、降低了被孢霉门（Mortierellomycota） 的相对丰度，子囊菌门（Ascomycota）分别增加了24.43%、68.24%、121.94%，被孢霉门（Mortierellomycota） 分别降低了3.70%、23.04%、58.25%。L 处理增加了毛霉门（Mucoromycota） 与担子菌门（Basidiomycota） 在土壤中的相对丰度，LGM与GM 处理则不同程度降低了上述两个菌门的相对丰度。

由图2 可知，腐质霉属（Humicola）、被孢霉属（Mortierella）、镰刀菌属（Fusarium）、短梗蠕孢属（Trichocladium）、Apodus、木霉属（Trichoderma）、毛霉属（Mucor） 为土壤中的优势菌属，其相对丰度之和占到了各组总测序丰度的55.23%～72.01%。相比CK 处理，L、LGM 和GM 3 个处理均不同程度降低了被孢霉属（Mortierella）、镰刀菌属（Fusarium） 在土壤中的相对丰度，被孢霉属（Mortierella） 的降幅分别为3.70%、23.71%、59.37%，镰刀菌属（Fusarium）的降幅分别为19.32%、13.78%、9.71%。L、LGM和GM 3 个处理均大幅增加了腐质霉属（Humicola）、短梗蠕孢属（Trichocladium） 在土壤中的相对丰度，经过不同土壤改良措施处理后腐质霉属（Humicola）在3 个处理中相对丰度分别是CK 处理的1.58、3.66、5.39 倍，短梗蠕孢属（Trichocladium） 在3 个处理中相对丰度分别是CK 处理的5.39、2.73、4.85 倍。另外，GM 处理能增加土壤中木霉属（Trichoderma） 的相对丰度，相比CK 处理可增加81.03%，L 处理则能增加毛霉属（Mucor） 的相对丰度，相比CK 处理可增加76.94%。

使用 LEfSe 分析工具在不同处理样品之间寻找各真菌分类水平上与CK 处理具有统计学差异的Biomarker，生成LDA 值分布柱状图（图3）。由图3可知，相比CK 处理，L、LGM 和GM 3 个处理均能显著提高土壤中子囊菌门（Ascomycota）、粪壳菌纲（Sordariomycetes）、粪壳菌目（Sordariales）、毛壳菌科（Chaetomiaceae） 的相对丰度。不同于GM 处理，L和LGM 处理显著提高短梗蠕孢属（Trichocladium）与该菌属中griseum 的相对丰度。不同于L 处理，GM和LGM 处理显著提高腐质霉属（Humicola） 与该菌属中phialophoroides 的相对丰度。L 处理即施石灰能显著降低被孢霉属中chlamydospora 的相对丰度，GM处理即绿肥还田能显著降低担子菌门（Basidiomycota）的相对丰度，显著增加Apodus 与该菌属中oryzae 的丰度，LGM 处理即施石灰+绿肥还田能显著降低被孢霉属中indohii 菌种的相对丰度。

2.6 不同处理对真菌群落营养型结构与真菌功能群的影响

根据FUNGuild 数据库的比对结果，对不同处理烟田土壤中真菌的营养型（trophic mode） 进行分类统计（图4）。各处理土壤中真菌的营养型均以腐生营养型（saprotroph） 为主，占比为48.12%～65.60%，病理营养型（pathotroph） 次之，占比为12.79%～13.61%。L、LGM 和GM 3 个处理中腐生营养型真菌占比均高于CK 处理，分别高出CK 处理10.81%、13.24%、17.48%。L、LGM 和GM 3 个处理中病理营养型真菌占比则分别低出CK 处理5.98%、6.03%、5.12%。共生营养型真菌在所有处理中占比均较低，低于3.00%。此外，各处理中均有大量真菌营养型尚未被鉴别。

由图5 可以看出，对土壤中的真菌按其功能进行划分，相对丰度在1% 以上的有未定义腐生真菌、未定义真菌、植物病原真菌、寄生虫真菌、粪便腐生真菌，其相对丰度之和占土壤中真菌总和的96.45%～98.92%。L、LGM 和GM 3 个处理均能降低植物病原真菌的相对丰度，经相应土壤改良处理后，CK 处理中植物病原真菌的相对丰度分别为L、LGM、GM 的1.06、1.08、1.13 倍。LGM、GM 处理能大幅提高未定义腐生真菌的相对丰度，相比CK处理分别高出28.57%、35.50%。L 和GM 处理则均能提高土壤中寄生虫真菌与粪便腐生真菌的相对丰度，相比CK 处理分别提高寄生虫真菌22.72%、43.98%，提高粪便腐生真菌112.70%、44.27%。

2.7 不同处理对雪茄烟经济效益的影响

3 种土壤改良措施对雪茄烟经济效益均有较大影响 （表4）。相比CK 处理均可提高雪茄烟均价、产量及产值，其中均价提高5.62%～5.91%，产量提高8.44%～20.68%，L、LGM 和GM 处理产值分别提高14.56%、27.45% 和21.47%。LGM 处理增产率、增值率分别略高于GM 处理5.93、5.98 个百分点，GM 处理均价增长率略高于LGM 处理0.22 个百分点。综合来看，LGM 和GM 处理提升雪茄烟经济效益的效果要优于L 处理。

3 讨论

对长期连作雪茄烟田施石灰、施石灰+绿肥还田、绿肥还田均能不同程度提高土壤速效养分含量，增加土壤微生物总量，改善土壤中真菌群落结构，从而促进雪茄烟健康生长，增加雪茄烟经济效益。3 种土壤改良措施均能不同程度增加土壤全氮、有机质、碱解氮及速效钾养分含量，且以施石灰+绿肥还田效果最佳，但提高土壤pH 值，改善土壤酸化现象则以施石灰效果最佳。可能原因是绿肥腐解过程中产生了一定量有机酸，降低了土壤pH 值，而石灰属于碱性物质，本身不仅能显著提高土壤的pH值，还能加速绿肥的腐烂与氮素的释放，提高还田效果[14]。3 种土壤改良措施均可增加土壤中细菌、放线菌及微生物总量，且以施石灰+绿肥还田效果最好。但3 种改良措施中仅绿肥还田能增加土壤中真菌数量，施石灰、施石灰+绿肥还田反而会降低真菌数量。3 种土壤改良措施对土壤中真菌群落结构影响较大并存在显著差异，且绿肥还田、施石灰+绿肥还田的影响要大于施石灰。绿肥还田处理真菌Shannon指数、Chao1 指数最高，即该处理真菌多样性与真菌丰富度高于施石灰、施石灰+绿肥还田，可能原因是施石灰提高了土壤pH 值，真菌生长环境酸性减弱碱性增强，不利于真菌的繁殖[15]，因此施石灰处理真菌多样性相比对照有所降低。其次绿肥在田间腐烂后，增加了碳、氮源的投入，为土壤中真菌等微生物的生长、繁殖提供了大量的营养物质[16]，因而能显著增加真菌数量，提高群落的多样性及丰富度。施石灰+绿肥还田处理因为增加了石灰，因而真菌多样性与丰富度要低于绿肥还田处理。上述部分研究结论与Ryota 等[17]将野豌豆作为绿肥翻压可提高土壤的真菌生物量，提高真菌丰富度的研究结果相同，但与杨思等[18]在麦后复种苜蓿压青还田降低土壤真菌丰富度的研究结论不同。

物种注释分析结果显示，3 种土壤改良措施对土壤中真菌门、属水平上组成结构的影响存在较大差异。施石灰处理可增加毛霉属（Mucor） 的相对丰度，绿肥还田处理可增加木霉属（Trichoderma） 的相对丰度。木霉属（Trichoderma） 真菌大量分布于土壤、植物残体、植物根际等环境中，对多种细菌和病原真菌具有拮抗作用[19]。此外，3 种土壤改良措施均能不同程度降低病原菌镰刀菌属（Fusarium） 的相对丰度，该菌属于烟草致病菌，可引发烟草的镰刀菌根腐病[ 2 0 ]，在施石灰处理中的相对丰度最低，低于CK 处理19.32%。可能原因是石灰本身具有一定的干燥和杀菌功能[21]，而绿肥还田能增加有益菌木霉属的相对丰度，抑制病原菌的产生。因此，3 种土壤改良措施均能从不同方面改善土壤真菌群落结构，为雪茄烟生长发育提供良好的土壤微生态环境，从而不同程度增加雪茄烟产量与产值。

LEfSe 分析结果显示，3 种土壤改良措施均能显著提高土壤中子囊菌门—粪壳菌纲—粪壳菌目—毛壳菌科的相对丰度。毛壳菌科真菌除与纤维素降解相关外，还可产生抑菌活性物质，并诱导植物产生抗性[22−23]。这也解释了3 种土壤改良措施处理中病原菌镰刀菌属相对丰度均低于对照的原因。施石灰+绿肥还田、绿肥还田二者能显著提高腐质霉属（Humicola）的相对丰度。这与赵竟茹等[24]向红壤旱地添加毛叶苕子可显著增加土壤中腐质霉属相对丰度的研究结果一致。腐质霉属真菌分解植物残体能力较强，具有较高的木聚糖酶、纤维二糖水解酶和纤维素酶活性[25]，对植物的健康生长有利。另外，腐质霉属真菌具有缓解土壤砷毒害和促进植物生长的功能[26]。

FUNGuild 分析表明，3 种土壤改良措施均能不同程度降低植物病原真菌的相对丰度，优化真菌的营养型组成结构，提高腐生营养型真菌占比，降低病理营养型真菌占比，且以绿肥还田处理改良效果最佳。这与赵竟茹等[24]向红壤旱地添加毛叶苕子可显著增加土壤腐生营养型真菌相对丰度的研究结论相同。

施石灰改善土壤真菌群落结构的效果不如绿肥还田的原因可能是，石灰虽能有效缓解土壤的酸化现象，但由于提高了土壤的pH 值，而高 pH 有利于细菌的生长，低 pH 值有利于真菌的生长[15]，石灰施入土壤中在杀死病原菌的同时，也杀死了部分其它真菌。另外，绿肥还田能显著提高土壤中真菌生物量，增加真菌群落的丰富度，特别是有益菌木霉属、腐质霉属等有益菌属的相对丰度，在提高植物抗逆性的同时与土壤中的病原菌进行生态位和营养物质的竞争，从而抑制病原菌在土壤中生长繁殖，促进土壤真菌群落结构和功能类群向健康有益方向发展。

4 结论

在恩施雪茄烟生产中，采用施石灰、施石灰+绿肥还田、绿肥还田3 种土壤改良措施均可不同程度改善长期连作烟田土壤理化性状，增加土壤微生物总量，改善土壤真菌群落组成和结构，从而促进雪茄烟健康生长，增加雪茄烟生产经济效益。3 种土壤改良措施均能增加有益菌毛壳菌科的相对丰度，降低病原菌镰刀菌属的相对丰度。此外，3 种土壤改良措施还能改善真菌群落功能组成，优化真菌的营养型组成结构，在提高腐生营养型真菌占比的同时降低病理营养型真菌占比，达到改良土壤、提高雪茄烟生产经济效益的目的。3 种土壤改良措施中以绿肥还田处理改善连作烟田土壤真菌群落结构效果最佳，且施石灰+绿肥还田、绿肥还田提高土壤肥力、增加雪茄烟经济性状效果要优于单施石灰。