落叶型棉花黄萎病的生物学特征及药剂防治分析

摘 要：【目的】比较研究新疆昌吉市和沙湾市落叶型棉花黄萎病病原菌的生物学特性，分析的多菌灵、乙蒜素、唑酮乙蒜素、枯草芽孢杆菌和哈茨木霉菌5种农药对棉花黄萎病的防治效果，筛选出高效的药剂用于指导棉花病害防治。

【方法】采用菌丝生长速率法，通过不同离子、pH值、碳源及温度生长的适应，分析各病原菌的主要生物学特性，并对5种农药进行室内毒力测定。

【结果】昌吉市和沙湾市各病原菌生长最适温度为20～25℃，最适离子培养基为Ca2+，最适pH值5～7，最适碳源是蔗糖。5种供试药剂均对各病原菌具有明显的抑制效果。多菌灵、枯草芽孢杆菌、哈茨木霉菌对病原菌的抑制作用极强，昌吉市多菌灵、枯草芽孢杆菌、哈茨木霉菌其抑制中浓度EC50值仅分别为0.292 3～0.819 3 μg/mL、0.016 61～0.026 95 μg/mL和0.101 5～0.884 6 μg/mL，沙湾市EC50值分别为0.358 8～5.694 μg/mL、1.813×10-2～2.727×10-2" μg/mL和0.181 0～0.608 8 μg/mL；而乙蒜素、唑酮乙蒜素对病原菌的防效最差，其EC50在昌吉市分别高达71.04 、111.6 μg/mL，沙湾市分别为79.22、171.7 μg/mL。

【结论】昌吉市、沙湾市的各病原菌最适生长的温度为25℃，含Ca2+培养基为最适离子培养基。各病原菌在pH 值5～7时生长速率最快，最适生长环境为酸性环境，对偏碱性环境也有较好的耐受性。微菌核在偏碱性的环境下更易形成，在以蔗糖为碳源的培养基上的生长速率最快。多菌灵、枯草芽孢杆菌、哈茨木霉菌对棉花黄萎病菌有强抑菌作用，可在昌吉市和沙湾市用于防治棉花黄萎病。

关键词：落叶型棉花；黄萎病；生物学特性；菌丝生长速率法；毒力测定

中图分类号：S435.62 ""文献标志码：A ""文章编号：1001-4330（2024）08-2034-09

收稿日期（Received）：2024-01-28

基金项目：农业发展资金项目（20220126）；农业创新资金项目（2020026528-1）

作者简介：赖成霞（1972-），女，新疆乌鲁木齐人，副研究员，研究方向为棉花抗逆分子育种，（E-mail）lchxia2001@163.com

通讯作者：马君（1983-），男，甘肃民勤人，副研究员，研究方向为棉花种质资源，（E-mail）xj.majun@163.com

0 引 言

【研究意义】棉花黄萎病（Verticillium wilt）是由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb）［1］侵染棉花维管束而发生的一种系统性的真菌病害，微菌核是该病发生的主要初侵染源，可在土壤中可存活14年之久，其数量及存活状况直接影响着黄萎病发生的危害程度［2-3］。致病力分化是造成该病反复危害的主要原因［4-5］。新疆棉花黄萎病发病面积2021年占播种面积的50%以上［6］，新疆北疆地区棉花黄萎病的发生逐渐呈增加态势，强致病性菌株以菌核型为主，占黄萎病菌株的 94.12%以上［7］，新疆生境特殊、棉花品种混杂导致大丽轮枝菌对生态环境具有多样性、变异性的特点，从而让抗病性育种更加困难。针对性研究该病的生物学特性及防治药剂，对有效防治该病害有重要意义。【前人研究进展】2004～2007年段维军［8］等和张莉［9］等发现，新疆黄萎病菌存在强、中、 弱 3 种 致 病 类 型 ，其中中等致病力的菌株居多，并发现了落叶型菌株。2011～2023年，新疆北疆地区的黄萎病菌的强致病性菌株占比由51.2%［10］、73.3%［11］发展至76.5%［7］。刘海洋等［6］对新疆北疆石河子、奎屯、博乐等8市（县）棉田棉花黄萎病进行抽样调查，发现棉田中落叶型黄萎病呈绝对优势，高达97.6%，目前已有多种农药被引入棉田用于防治棉花黄萎病，如乙蒜素［12］、枯草芽孢杆菌［13］、哈茨木霉菌［14］、多菌灵［15］等，并且通过多种药药结合、菌药结合等方式可以将棉花黄萎病在发病初期控制在40%以下。【本研究切入点】大丽轮枝菌引起的棉花黄萎病是棉花最严重的病害之一，昌吉市和沙湾市是新疆北疆棉花主要种植区，需针对性研究昌吉市和沙湾市棉花黄萎病的生物学特性和筛选高效药剂。【拟解决的关键问题】采用菌丝生长速率法，研究昌吉市和沙湾市黄萎病病原菌温度适应性、离子适应性、酸碱度适应性、碳源需求特性以及等生物学特征，并针对生产上常用的杀菌剂，筛选出对黄萎病菌具有显著效力的杀菌剂，为新疆北疆棉花黄萎病精准防治提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 棉花黄萎病病原菌株的分离培养及命名

从昌吉市腾飞农场和沙湾市四道河子试验站的棉田中采集黄萎病发病植株，并将发病的棉花植株在70%的乙醇中消毒30s后，在15%的NaClO中消毒5min中，将植株的维管系统放置在PDA培养基上培养。从昌吉市分离获得4个大丽轮枝菌被命名为Vc-1，Vc-2，Vc-3，Vc-4；从沙湾市分离的6个大丽轮枝菌被分别命名为Vd-1，Vd-2，Vd-3，Vd-4，Vd-5，Vd-6。对照菌株V991（Verticillium daliae Kleb）由华中农业大学植物学院朱龙付课题组提供。

1.1.2 供试药剂及农药

马铃薯葡萄糖琼脂（Potato dextrose agar，PDA）培养基，马铃薯葡萄糖培养基（Potato dextrose，PD）英国Oxoid公司）。其他试剂均为国产试剂。

50%多菌灵可湿性粉剂（威海韩孚生化药业有限公司），20.0×108/mL枯草芽孢杆菌剂（河北威远生物化工有效公司），80%乙蒜素乳油（开封大地农化生物科技有限公司），32%唑酮乙蒜素乳油（开封大地农化生物科技有限公司），5.0×108/g哈茨木霉菌粉剂（辽宁土木启生物科技有限公司）。

1.2 方 法

1.2.1 培养基配制

马铃薯葡萄糖琼脂（Potato dextrose agar，PDA）培养基为培养棉花黃萎病菌丝的固体培养基，培养基按照生产商提供的方法配制，即1 L水中加入39 g PDA干粉，煮沸完全溶解后，121℃高压灭菌15 min，再倒板；固体查氏（Czapek）培养基：1 L水中加入葡萄糖30 g，NaNO3" 2 g，K2HPO4·3H2O 1 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，12 g琼脂，121℃高压灭菌15 min。

1.2.2 不同温度对病原菌生长速率的影响

以PDA培养基为基础培养基，在纯化培养好的各病原菌菌落边缘利用直径为5 mm的打孔器进行打孔，并将病原菌菌饼接入培养基中央，分别置于10、15、20、25和30℃的恒温培养箱中培养。并在培养14 d后观察菌落特征，利用十字交叉法测量菌落直径，计算生长速率，分析病原菌生长速率和最适生长温度，每个处理设置3～5个重复。

1.2.3 不同离子对病原菌生长速率的影响

以PDA培养基为基础培养基，分别加入Na+、K+、Mg2+和Ca2+等离子制成浓度为0.1 M的不同离子培养基，将菌饼放入平板中央进行培养，以无菌水为对照，置于25℃的恒温培养箱中培养。分别于12 d观察菌落特征，利用十字交叉法测量菌落直径，计算生长速率，每个处理设置3～5个重复。

1.2.4 不同pH值对病原菌生长速率的影响

以PDA培养基为基础培养基，分别将培养基用HCl或NaOH将pH值调节至用5、6、7、8和9，并将菌饼放入平板中央进行25℃培养，在培养14 d后观察菌落特征，利用十字交叉法测量菌落直径，计算生长速率，每个处理设置3～5个重复。

1.2.5 不同碳源对病原菌生长速率的影响

以查氏（Czapek）培养基为基础培养基，以蔗糖，脱脂奶粉2个碳源对培养基中的葡萄糖进行C量代换，其中蔗糖为20 g，脱脂奶粉为18 g，将菌饼放入平板中央进行25℃培养，培养12 d后观察菌落特征，利用十字交叉法测量菌落直径，计算生长速率，每个处理设置3～5个重复。

1.2.6 不同农药对病原菌生长的影响

将各农药分别设置为5个浓度梯度，多菌灵设置成5.0、5.6、6.25、10和12.5 μg/mL，枯草芽孢杆菌设置成0.078、0.156、0.312、1.25和12.50 μg/mL ，乙蒜素设置成25.0、33.3、40.0、66.7和100.0 μg/mL，唑酮乙蒜素设置成25.00、33.00、66.67、100和200 μg/mL，哈茨木霉菌设置成2×10-4、6.25×10-3、2.5×10-3、5×10-3和10 μg/mL，以PDA为基本培养基，按照上述各农药浓度中制成含药平板，以无菌水为对照。在含药平板中央接种菌饼，25℃恒温培养。每处理设3～5个重复，培养14 d后采用十字交叉法测量菌落直径，计算抑菌率，由GraphPad Prism 8求得毒力回归方程、抑制中浓度（EC50） 和相关系数（R2） ，根据EC50值评价各杀菌剂的抑菌效果

抑菌率%=［（对照菌直径-处理菌落）/（对照菌落直径-5）］×100%。

将药剂浓度换算成浓度对数（X），菌丝生长抑制率换算成抑制机率值（Y），计算各药剂的抑制中浓度的EC50值。

1.3 数据处理

数据处理采用Microsoft Excel进行数据处理，SPSS 26进行统计学分析，利用GraphPad Prism 8计算各农药的EC50值，用Origin 2018 、Photoshop 2014进行图片处理。

2 结果与分析

2.1 不同温度对病原菌生长速率的影响

研究表明，昌吉市、沙湾市棉花黄萎病病原菌在不同温度下生长速率具有显著差异，昌吉市菌具有一定的低温耐性，当温度为10～25℃时，其生长速率比沙湾市的病原菌生长速率快，其中10℃时病原菌Vc-2为0.160 cm/d，15℃时Vc-1为0.289 cm/d，20℃时Vc-3为0.373 cm/d，25℃时Vc-2为0.426 cm/d，随着温度的升高，两地菌的生长速率明显放缓，但与昌吉市的菌系相比，沙湾市大丽轮枝菌的生长速度明显增快，其中Vd-1和Vd-5两个菌生长速率可达0.250 cm/d，而昌吉市生长最快的菌Vc-3也仅为0.135 cm/d，生长速率比沙湾市的菌降低了1.85倍，病原菌的最适生长温度均为25℃，昌吉市病原菌具有一定的低温耐性，沙湾市病原菌具有一定的高温耐性。表1

2.2 不同的离子对病原菌菌丝的影响

研究表明，棉花黄萎病病原菌在Ca2+、Na+、Mg2+和K+等4种不同离子的培养基上的生长速率具有明显差异，昌吉市和沙湾市的病原菌在K+培养基的生长速率基本接近，病原菌Vd-1、Vc-2、Vc-3的生长速率最快，生长速率分别为0.407、0.413和0.413 cm/d，在Ca2+、Mg2+培养基上，来自沙湾市的病原菌Vd-3和Vd-5的生长速率最快，分别可达0.457和0.395 cm/d。在Na+培养基上，菌生长速率均放缓，而沙湾市病原菌Vd-3，Vd-4的生长速率最快，速率仅为0.367和0.372 cm/d。Na+培养基上的病原菌生长最为缓慢，不适宜黄萎病病原菌的生长，Ca2+培养基上的生长最快，适宜黄萎病病原菌的生长。图1

2.3 不同pH值对病原菌生长速率的影响

研究表明，棉花黄萎病病原菌在pH值5～9时均可生长，随着 pH 值的增高，碱性增强，菌丝生长速度减慢，与沙湾市的病原菌相比，昌吉市的某些菌株具有较高的酸碱度耐性，病原菌Vc-3在pH值5、7和8时的生长速度最快可分别达0.406、0.400和0.374 cm/d，病原菌Vc-2 在pH值6、9 时的生长速率分别为0.400和0.332 cm/d。两地的各病原菌在同一pH值条件下的生长速率也有明显分化，在pH 值5～7时生长速率最快，最适生长环境为酸性环境，对偏碱性环境也有较好的耐受性。棉花黄萎病病原菌的微菌核在偏碱性的环境下更容易形成。表2

2.4 不同的碳源对病原菌生长速率的影响

研究表明，棉花黄萎病病原菌在脱脂奶粉和蔗糖为碳源的2种培养基上均能正常生长，病原菌在2种碳源培养基上的生长速率有显著差异，其中棉花黄萎病病原菌在蔗糖为碳源的培养基上的生长速率最快，为最适碳源培养基，沙湾市的病原菌和昌吉市的病原菌Vd-3、Vd-6、Vc-4的生长速率最快，生长速率分别为0.453、0.449、0.453 cm/d，昌吉市的病原菌Vc-1的生长速率较慢，生长速率为0.375 cm/d。其次是以脱脂奶粉为碳源的培养基，沙湾市和昌吉市的病原菌Vd-2、Vd-4、Vc-1、Vc-2的生长速率最快，生长速率分别为0.454、0.445、0.448和0.439 cm/d，沙湾市的病原菌Vd-1，Vd-5的生长速率较慢，生长速率分别为0.380和0.370 cm/d。图2

2.5 棉花黄萎病病原菌抑菌药剂室内筛选

研究表明，多菌灵、枯草芽孢杆菌及哈茨木霉菌对病原菌的生长具有较好的抑制作用。多菌灵对沙湾市的病原菌Vd-3和昌吉市的病原菌Vc-4以及内地病原菌V991的抑菌率较好，EC50值分别为0.358 8、0.292 3及0.228 6 μg/mL，并且沙湾市和昌吉市的病原菌对多菌灵的敏感度大于V991。乙蒜素和唑酮乙蒜素仅对沙湾市的Vd-3和昌吉市的Vc-2及沙湾市的Vd-2和昌吉市的Vc-4具有良好的抑菌效果，EC50值分别为32.32和41.49 μg/mL及26.08和84.82 μg/mL，而对内地的病原菌V991的抑菌率较差，EC50值高达88.65 μg/mL，枯草芽孢杆菌分别对沙湾市的病原菌Vd-2和昌吉市的病原菌Vc-3及内地病原菌V991的抑菌率较好，EC50值分别为1.813×10-2 、1.661×10-2 和1.538×10-2 μg/mL，枯草芽孢杆菌

对内地病原菌的敏感度大于沙湾市和昌吉市的病原菌。哈茨木霉菌分别对来自沙湾市的Vd-1和昌吉市的Vc-3及V991的抑菌率较好，EC50值分别为0.181 、0.1015 和0.2695 μg/mL。哈茨木霉菌药剂对V991敏感度大于沙湾市和昌吉市的病原菌。多菌灵、枯草芽孢杆菌及哈茨木霉菌是能有效防治两地棉花黄萎病的有效制剂，而乙蒜素及唑酮乙蒜素对棉花黄萎病防效较差，不适宜为防治棉花黄萎病的药剂。图3

3 讨 论

多菌灵、乙蒜素、枯草芽孢杆菌、哈茨木霉菌等化学农药与生物制剂是棉花黄萎病防治有效农药，如滴施木霉菌剂18.0 kg/667m2，可有效控制黄萎的蔓延，其防效可高达68.16%［15］，10×108 g枯草芽孢杆菌叶面喷雾的最佳浓度为300～600倍液，防治效果可达54.35%～57.35%［16］。80%乙蒜素乳油 800倍液对棉花黄萎病的防效为76.36%［17］。生物制剂和多菌灵混合可有效防治棉花黄萎病［18］。研究针对性研究沙湾市和昌吉市的棉花黄萎病生物学特性，发现昌吉市和沙湾市的棉花黄萎病病原菌在不同的离子、酸碱度、温度和不同的碳源下的生长速率，形态，微菌核的形成，菌丝的生长密度均存在一定的差异性，对离子和碳源利用方面，昌吉市的病原菌Vc-2和沙湾市的d-2和Vd-4能较高利用Na+、K+、Ca2+、Mg2+。昌吉市的Vc-4和Vc-1和沙湾市的Vd-6和Vd-2对蔗糖和脱脂奶粉有较高的利用。昌吉市的病原菌有一定低温耐性，而沙湾市的病原菌有一定的高温耐性，且病原菌最佳生长温度均为25℃，病原菌在同一pH值条件下的生长速率有明显分化，其中昌吉市的部分菌株对酸碱度的耐性更高。5种杀菌剂对昌吉市、沙湾市大丽轮枝菌的毒力差异显著，蒜素、唑酮乙蒜素对黄萎病菌的抑菌作用较差，在昌吉市和沙湾市EC50值分别高达71.04 、111.6和79.22 、171.7 μg/mL。试验研究为室内毒力试验，其施用方式、施用时间、防病机理以及大田防病效果仍需进一步研究。

4 结 论

昌吉市、沙湾市棉花各病原菌最适生长的温度为25℃，Ca2+培养基为最适培养基，两市的各病原菌在pH值5～7时生长速率最快，最适生长环境为酸性环境，对偏碱性环境也有较好的耐受性。微菌核在偏碱性的环境下更易形成，昌吉市、沙湾市病原以蔗糖为碳源的培养基上的生长速率最快，为最适碳源培养基。5种杀菌剂对两市大丽轮枝菌的毒力差异显著，乙蒜素、唑酮乙蒜素对黄萎病菌的抑菌作用较差，5种药剂对昌吉市和沙湾市棉花病原菌的毒力依次为枯草芽孢杆菌gt;哈茨木霉菌gt;多菌灵gt;乙蒜素gt;唑酮乙蒜素。

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Biological characteristics and chemical control of

defoliating cotton Verticillium wilt

LAI Chengxia1， YANG Yanlong1，LI Chunping1， Mayila Yusuyin1， WANG Yan2， YANG Dong3，

YANG Ni1， GE Fengwei4， WANG Penglong1， MA Jun1

（1.Research Institute of Economic Crops， Xinjiang Academy of Agricultural Sciences， Urumqi 830091， China; 2. College of Science and Technology， Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830091， China; 3. Plant Protection Station of Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830049， China; 4.College of Life Sciences， Xinjiang Normal University， Urumqi 830054， China）

Abstract：【Objective】 To compare the biological characteristics of defoliating cotton verticillium wilt pathogens from Changji and Shawan and clarify the control effects of carbendazim， ethyl allicin， ethyl azolone， that is， Bacillus subtilis and Trichoderma harzicum， which were commonly used in local production， on cotton verticillium wilt will be determined， and efficient and effective agents selected to guide the control of cotton disease.

【Methods】 The mycelial growth rate method was used to investigate the main biological characteristics of various pathogenic bacteria through adaptive growth of different ions， pH， carbon sources， and temperature. Meanwhile，the toxicity of five pesticides was measured indoors.

【Results】 The optimal temperature for the growth of pathogenic bacteria in Changji City and Shawan City was 20-25 ℃， the optimal ion culture medium was Ca2+， the optimal pH was 5-7， and the optimal carbon source was sucrose. All the 5 tested drugs had significantly different inhibitory effects on various pathogenic bacteria. Carbendazim， Bacillus subtilis and Trichoderma harzianum had strong inhibitory effects on pathogenic bacteria. The EC50 of carbendazim， Bacillus subtilis and Trichoderma harzianum to Changji was respectively 0.292，3-0.819，3 μg/mL，1.661×10-2-2.695×10-2 μg/mL， 0.101，5-0.884，6 μg/mL， for Shawan， 0.358，8 -5.694 μg/mL， 1.813 ×10-2-2.727 ×10-2 μg/mL，0.181，0-0.608，8 μg/mL， respectively， while allicin and azolidinone had the worst control effect on pathogenic bacteria， with an EC50 of 71.04 μg/mL、111.6 μg/mL in the Changji area and in the Shawan area 79.22 and 171.7 μg/mL.

【Conclusion】 In Changji and Shawan， 25 ℃ is the ideal temperature for the growth of several pathogens， and the ideal ion medium is the one that contains Ca2+. Different infections develop fastest in pH values between 5 and 7， therefore acidic environments are ideal for their growth. Additionally， they can withstand alkaline conditions well. Microsclerotia develop quickest on culture media containing sucrose as the carbon source and are more likely to occur in alkaline settings. Carbendazim， Bacillus subtilis and Trichoderma harzianum have strong bacteriostatic effects on cotton Vverticillium wilt in Changji and Shawan， which can be used to prevent and control the cotton disease.

Key words：defoliating pathotype；Verticillium wilt；biological characteristics；mycelial growth rate method；toxicity determination

Fund projects：The Agricultural Development Fund Project （20220126） ； The Agricultural Innovation Fund Project （2020026528-1）

Correspondence author：MA Jun（1983-），male，from Minqin， Gansu， associate researcher， research directon：Cotton germplasm resources and related research， （E-mail）xj.majun@163.com