赤灵芝多糖对ETEC所致肠炎的影响及机制研究

[摘要]"目的"研究赤灵芝多糖（ganoderma"lucidum"polysaccharides，GLP）对产肠毒素型大肠杆菌（enterotoxigenic"Escherichia"coli，ETEC）诱导小鼠肠炎的作用效果及机制。方法"选用24只6～8周龄雄性SPF级昆明小鼠，利用ETEC菌液腹腔注射诱导建立小鼠肠炎模型。采用随机数字表法分为为正常组、ETEC感染组、ETEC感染+高剂量GLP组，ETEC感染+低剂量GLP组，每组6只。采用HE染色观察小鼠小肠组织病理变化，采用免疫印迹法检测各组小鼠小肠组织中C反应蛋白（C-reactive"protein，CRP）、肿瘤坏死因子（tumour"necrosis"factor，TNF）-α和白细胞介素（interleukin，IL）-6蛋白的表达情况。检测各组小鼠小肠组织中Toll-样受体4（Toll-like"receptor４，TLR4）、核因子κB"p65亚基（nuclear"factor-κB"p65，NF-κB"p65）、髓样分化因子88（myeloid"differentiation"factor88，MyD88）mRNA的表达水平，探查GLP通过TLR4核因子κB（nuclear"factor-κB，NF-κB）信号通路对ETEC诱导的小鼠肠道炎症的调控作用。结果"与正常组比较，ETEC感染组小鼠出现精神萎靡，食欲减弱，小肠绒毛破损，组织中可发现大量的炎性浸润，疾病活动指数（disease"activity"index，DAI）呈上升趋势（Plt;0.05），小鼠小肠组织中TLR4、NF-κB"p65、MyD88"mRNA的相对表达量和CRP、TNF-α、IL-6的蛋白表达水平增高（Plt;0.01）。与ETEC感染组比较，ETEC感染+不同剂量组中小鼠精神状态和食欲有所改善，小鼠小肠组织中TLR4、NF-κBp65、MyD88的mRNA相对表达量均降低（Plt;0.01）。ETEC感染+高剂量组中小鼠小肠组织CRP、TNF-α、IL-6蛋白表达水平降低（Plt;0.01），ETEC感染+低剂量组降低程度差异无统计学意义（Pgt;0.05）。与ETEC感染+低剂量组比较，ETEC感染+高剂量组小鼠小肠组织TLR4、MyD88"mRNA的相对表达量和IL-6蛋白表达水平均降低（Plt;0.05）。结论"GLP可有效缓解ETEC诱导的小鼠肠道的炎症，且可能通过调控TLR4/NF-κB信号通路发挥抗炎作用，其作用效果可能与浓度呈正比。

[关键词]"灵芝多糖；产肠毒素型大肠杆菌；炎症因子

[中图分类号]"R285.5""""""[文献标识码]"A""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.35.015

Impact"and"mechanisms"of"ganoderma"lucidum"polysaccharide"on"ETEC-induced"enteritis

HUANG"Kexiang，"TAN"Feitong，"PAN"Tangxin，"XING"Dong，"XIAO"Ruyan，"HOU"Juan，"JIA"Wei

Jishou"University"School"of"Medicine，"Jishou"416000，"Hunan，"China

[Abstract]"Objective"To"study"on"the"effects"and"mechanisms"of"ganoderma"lucidum"polysaccharides"（GLP）"on"enteritis"induced"by"enterotoxigenic"Escherichia"coli"（ETEC）"in"mice."Methods"Twenty-four"6-"to"8-"weeks"-old"male"SPF"Kunming"mice"were"selected."A"mouse"enteritis"model"was"induced"by"intraperitoneal"injection"of"ETEC"bacterial"suspension."Mice"were"divided"into"normal"group，"ETEC"infection"group，"ETEC"infection+high-dose"GLP"group，"and"ETEC"infection+"ow-dose"GLP"group"using"a"random"number"table"method，six"mice"in"each"group."Pathological"changes"in"mice"small"intestine"tissue"werenbsp;observed"through"HE"staining.The"expression"of"C-reactive"protein"（CRP），"tumor"necrosis"factor-"（TNF）-α，"and"interleukin"（IL）"-6"proteins"in"mice"small"intestine"tissues"were"detected"by"Western"blot"method，"and"expression"levels"of"Toll-like"receptor"4"（TLR4），"nuclear"factor-κB"（NF-κB）"p65，"and"myeloid"differentiation"factor"88"（MyD88）"mRNA"in"mice"small"intestine"tissues"were"detected"by"RT-qPCR"technique"to"explore"the"regulatory"effect"of"GLP"on"ETEC-induced"mice"intestinal"inflammation"through"TLR4/NF-κB"signaling"pathway."Results"Compared"with"control"group，"mice"infected"with"ETEC"showed"lethargy，"reduced"appetite，"damaged"intestinal"villi，"significant"inflammatory"infiltration"in"tissues，"and"an"increasing"trend"in"disease"activity"index"（DAI）"scores"（Plt;0.05）."The"relative"expression"levels"of"TLR4，"NF-κB"p65，"and"MyD88"mRNA，"as"well"as"protein"expression"levels"of"CRP，"TNF-α，"and"IL-6"in"small"intestine"tissues"of"mice，"were"significantly"increased"（Plt;0.01）.Compared"with"ETEC-infected"group，"mice"in"different"dosage"groups"showed"improvements"in"mental"status"and"appetite."The"relative"expression"levels"of"TLR4，"NF-κB"p65，"and"MyD88"mRNA"in"small"intestine"tissues"of"mice"were"significantly"decreased"in"all"dosage"groups"（Plt;0.01）."In"ETEC"infection+high-dose"group，"protein"expression"levels"of"CRP，"TNF-α，"and"IL-6"in"small"intestine"tissues"of"mice"were"significantly"decreased"（Plt;0.01），"while"the"decrease"in"ETEC"infection+low-dose"group"was"not"significant"（Pgt;0.05）."Compared"with"ETEC"infection+low-dose"group，"ETEC"infection+high-dose"group"showed"significant"decreases"in"relative"expression"levels"of"TLR4"and"MyD88"mRNA，"as"well"as"in"protein"expression"level"of"IL-6"in"small"intestine"tissues"of"mice"（Plt;0.01"or"Plt;0.05）."Conclusion"GLP"can"effectively"relieve"intestinal"inflammation"induced"by"ETEC，"and"may"exert"its"anti-inflammatory"effect"through"regulating"TLR4/NF-κB"signaling"pathway，"which"may"be"proportional"to"its"concentration.

[Key"words]"Ganoderma"lucidum"polysaccharide;"Enterotoxigenic"Escherichia"coli;"Inflammatory"factor

感染性肠炎发病率逐年上升，其中产肠毒素型大肠杆菌（enterotoxigenic"Escherichia"coli，ETEC）是感染性肠炎的主要致病菌，儿童和旅行者为易感人群，ETEC是发展中国家婴幼儿腹泻常见病因[1-3]。ETEC致病率可达20%～40%，感染后可出现急性水样腹泻，并伴有发烧、呕吐和脱水等症状，死亡率高达30%～50%[4]。研究表明ETEC可通过增加Toll样受体4（Toll-like"receptor"4，TLR4）核因子κB（nucear"factor-κB，NF-κB）激活TLR4/NF-κB信号通路，从而导致ETEC肠炎[5]。食源性疾病暴发事件中出现杂交混合型菌株，这些菌株含有多种毒力基因，对人类健康的危害越来越大[6]。通常选用抗生素治疗，随着抗生素的广泛使用，产生较高的耐药率[7]。

赤灵芝是一种名贵的中药材，性温，气味苦平无毒，有滋补强身、延年益寿等功效[8]。赤灵芝多糖（ganoderma"lucidum"polysaccharides，GLP）是赤灵芝的主要活性成分，具有免疫调节、抗炎等作用[9]。研究表明GLP对治疗癌症、糖尿病、心血管疾病等有很好的药用价值[10]。为进一步挖掘GLP的药用价值，本研究通过腹腔注射ETEC建立小鼠肠炎动物模型进行GLP对ETEC诱导的小鼠肠炎作用效果及机制研究，为临床治疗提供实验数据支持。

1""材料与方法

1.1""实验材料

GLP（浙江养芝康生物科技有限公司），ETEC（环凯微生物科技有限公司）。SPF级昆明小鼠[湖南斯莱克达实验动物有限公司，实验动物许可证号：SCXK（湘）2019-0017]；肿瘤坏死因子（tumour"necrosis"factor，TNF）-α兔多克隆抗体、白细胞介素（interleukin，IL）-6兔多克隆抗体、C反应蛋白（C-reactive"protein，CRP）兔多克隆抗体、实时荧光定量PCR试剂盒（碧云天有限公司）。

1.2""实验方法

将24只6～8周龄雄性SPF级昆明小鼠单笼喂养，自由饮食饮水，适应性饮食1周后，采用随机数字表法分为正常组、ETEC感染组、ETEC感染+高剂量GLP组、ETEC感染+低剂量GLP组，每组6只。参考文献[11-12]的方法，将ETEC悬液稀释至1×108CFU/ml。对ETEC感染组、ETEC感染+高剂量GLP组、ETEC感染+低剂量GLP组按体质量每克腹腔注射0.02ml的ETEC稀释液，正常组腹腔注射生理盐水，持续1周。根据疾病活动指数（disease"activity"index，DAI）对小鼠的体质量，粪便情况评估赋分。绘制曲线并分析，若曲线变化随时间的改变呈上升趋势则表明造模成功。造模完成后，将饮用水作为溶剂，GLP作为溶质，按浓度要求配置GLP液。ETEC感染+高剂量GLP组，ETEC感染+低剂量GLP组每天分别灌胃浓度为150mg/kg、50mg/kg的GLP液，正常组和ETEC感染组灌胃饮用水，持续2周。

1.3""观察指标

每天观察小鼠的精神、反应和行动是否正常及食欲和粪便性状是否改变，记录体质量。取小鼠小肠组织使用甲醛固定，进行切片。HE染色后，于显微镜下观察炎性浸润情况和肠绒毛的完整性等变化。根据炎症分级标准[13]进行组织学评分：无炎症征象（0分）；少量细胞浸润至黏膜层（1分）；单核细胞浸润导致隐窝分离、黏膜轻度增生（2分）；大量炎症细胞浸润，黏膜破坏，杯状细胞脱落，黏膜增生严重（3分）。

1.4""RT-PCR与蛋白检测

根据美国国家生物技术信息中心（National"Center"of"Biotechnology"Information，NCBI）数据库中小鼠的mRNA序列，委托生工生物工程（上海）股份有限公司设计合成。取15～20mg小肠组织，置于液氮中研磨成粉末，并加入裂解液。待裂解完全后进行纯化洗脱得到纯化的RNA。将纯化后的RNA进行反应，最后经RT-PCR检测各基因的转录水平。取小鼠小肠组织，于液氮低温研磨，提取蛋白。然后进行电泳，转膜封闭，并依次孵育一抗和二抗。孵育完成后进行显影成像，使用Image"J对其进行分析。

1.5""统计学方法

采用"GraphPad"Prism"8.0统计学软件对数据进行处理分析，计量资料以均数±标准差（"）表示，组间比较采用t检验，多组间样本均数比较采用单因素方差分析。Plt;0.05为差异有统计学意义。

2""结果

2.1""各组小鼠基本情况比较

实验期间，正常组小鼠精神和食欲正常，造模后小鼠精神萎靡，食欲减弱。GLP干预后，小鼠精神和食欲有所改善。两种剂量的GLP组间比较无差异。腹腔注射ETEC稀释液后，小鼠的体质量随注射天数出现下降。两种不同浓度的GLP溶液灌胃后，小鼠体质量均有上升。造模期间，造模组小鼠的DAI评分随天数的增长呈现上升趋势，与正常组比较，差异有统计学意义（Plt;0.05）。见图1。

2.2""各组小鼠的病理结果比较

正常组小鼠肠黏膜层、黏膜下层及肠绒毛未见明显异常，未有炎性浸润。与正常组比较，ETEC感染组小鼠小肠绒毛破损，有大量炎性浸润，组织学评分升高，差异有统计学意义（Plt;0.05）。ETEC感染+高剂量GLP组和ETEC感染+低剂量GLP组小鼠炎性浸润程度少于ETEC感染组，肠绒毛损伤程度减轻，组织学评分降低，与正常组比较，有小肠绒毛破损，轻微炎性浸润，差异有统计学意义（Plt;0.05），见图2。

2.3""TLR4/NF-κB信号通路关键mRNA的相对表达量

ETEC感染组小鼠TLR4、MyD88、NF-κBp65"mRNA的相对表达量高于正常组（Plt;0.01），ETEC感染+高剂量GLP组和ETEC感染+低剂量GLP组小鼠的TLR4、NF-κBp65、MyD88"mRNA的相对表达量低于ETEC感染组（Plt;0.01）。与ETEC感染+低剂量GLP组比较，ETEC感染+高剂量GLP组小鼠肠道组织中TLR4、MyD88"mRNA的相对表达量降低（Plt;0.01）。

2.4""各组小鼠的炎症因子蛋白表达水平比较

ETEC感染组中CRP、TNF-α、IL-6蛋白的相对表达量均高于正常组（Plt;0.01）。ETEC感染+高剂量GLP组中小鼠小肠组织CRP、TNF-α、IL-6蛋白的相对表达量低于ETEC感染组（Plt;0.01），ETEC感染+低剂量GLP组中小鼠小肠组织CRP、TNF-α、IL-6蛋白的相对表达量低于ETEC感染组，但差异无统计学意义（Pgt;0.05）。ETEC感染+高剂量GLP组中小鼠小肠组织IL-6蛋白的相对表达量低于ETEC感染+低剂量GLP组，差异有统计学意义（Plt;0.05），见图3。

3""讨论

ETEC属革兰阴性菌，主要通过菌毛黏附定植于细胞表面引起炎症反应[14-18]。TLR4作为TLR4/"NF-κB信号通路关键部分存在于细胞表面，可特异性识别脂多糖[19]。ETEC侵袭肠道后，其表面的脂多糖与肠道上皮细胞表面的TLR4受体特异性结合，激活TLR4/NF-κB信号通路，可促使IL-6、TNF-α等炎症因子产生[20-21]。CRP作为机体非特异性免疫中的一环，当发生感染或组织损伤时，其表达可随着炎症程度的增高而上升，尤其细菌感染，升高更明显[22]。造模后，小鼠体质量下降、精神萎靡，食欲减弱，小肠组织中TLR4、NF-κBp65、MyD88"mRNA的相对表达量和CRP、TNF-α、IL-6蛋白表达水平相较于正常组均明显升高。不同剂量的GLP灌胃后，小鼠小肠组织中TLR4/NF-κB信号通路关键mRNA和炎性因子蛋白的表达均降低。炎性因子蛋白的变化趋势与TLR4/NF-κB信号通路关键mRNA变化趋势一致。GLP可抑制通路中某蛋白的磷酸化而破坏信号通路，其抗炎作用可能与TLR4/NF-κB信号通路下调有关。本研究结果表明GLP治疗效果可能与其浓度呈正相关。GLP可促进小肠绒毛损伤愈合，可能与GLP降低肠通透性和血清D-乳酸水平增加小肠杯状细胞和免疫蛋白A分泌细胞的数量有关[23]。

近年来，中草药成分研究的不断深入和植物提取行业的发展，中草药中有效成分的药用价值逐渐提高；分为酸、多酚、多糖、萜类等[24]。多糖广泛存在于多种植物中，例如黄芪多糖、南瓜多糖、白术多糖等[25-26]。与其他多糖相比，GLP在抑菌和肠道菌群调节方面效果更明显。GLP是一种安全的生物活性成分，可提高人群免疫力，更有利于疾病的预防及减少治疗过程中产生的不良反应[27]。因此，相比于其他多糖具有更广泛的应用前景。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

[参考文献]

[1] 梁丹，"车荣飞，"石倩萍，"等."感染性腹泻疾病负担及其病原谱变化研究进展[J]."中国公共卫生，"2020，"36（11）："1651–1654.

[2] 李保良，"庞胜美，"吕林芬，"等."产肠毒素大肠杆菌诱导肠上皮细胞凋亡的研究进展[J]."微生物学报，"2023，"63（6）："2340–2349.

[3] 金玉娟，"刘渠，"陈应坚，"等."四种致泻性大肠埃希氏菌实验室检测研究进展[J]."中国热带医学，"2011，"11（1）："116–118.

[4] 许崇利，"佘玉罕，"付凤洋，"等."产肠毒素大肠杆菌四价基因工程灭活疫苗研制[J]."石河子大学学报（自然科学版），"2023，"41（5）："562–567.

[5] ALBERTO"F，"MARIANNA"R，"AMBRA"I，"et"al."Lactobacillus"amylovorus"inhibits"the"TLR4"inflammatory"signaling"triggered"by"enterotoxigenic"Escherichia"coli"via"modulation"of"the"negative"regulators"and"involvement"of"TLR2"in"intestinal"Caco-2"cells"and"pig"explants[J]."PLoS"One，"2017，"9（4）："e94891.

[6] 彭晶晶，"王淑云，"侯配斌，"等."致泻大肠埃希菌快速检测技术的研究进展[J]."预防医学论坛，"2024，"30（6）："476–480.

[7] KAREN"L"K."Bacterial"diarrhoea[J]."Curr"Opin"Pediatr，"2022，"34（2）："147–155.

[8] 代彦满，"陈书明，"张棋."赤灵芝菌种培养基的比较与筛选[J]."西北林学院学报，"2019，"34（4）："162–165.

[9] ZHANG"N，"HAN"Z，"ZHANG"R，"et"al."Ganoderma"lucidumnbsp;polysaccharides"ameliorate"acetaminophen-induced"acute"liver"injury"by"inhibiting"oxidative"stress"and"apoptosis"along"the"Nrf2"pathway[J]."Nutrients，"2024，"16（12）："1859.

[10] 陈奕君，"杨小梅，"林丽华."赤灵芝的营养成分、生物活性及其应用研究进展[J]."食品与机械，"2024，"40（6）："227–232.

[11] 赵荣山，"杨会锁，"郝京生，"等."使用大肠杆菌诱导小鼠腹泻模型[J]."医学动物防制，"2002（2）："85–86.

[12] 张凯琦."ETEC诱导的小鼠腹泻模型中小肠水通道蛋白表达水平的检测[D]."长春："吉林农业大学，"2017.

[13] 刘秋玲，"龚志华，"陈凌，"等."L-茶氨酸对产肠毒性大肠杆菌引起的免疫应激小鼠肝脏的保护作用研究[J]."茶叶科学，"2016，"36（5）："484–490.

[14] 张迪，"张凯琦，"苏维恒，"等."产肠毒素型大肠杆菌腹泻小鼠模型中小肠AQP3和AQP4的表达[J]."中国兽医科学，"2017，"47（10）："1309–1314.

[15] 杨阳，"黄兴法，"王东方，"等."产肠毒素大肠杆菌K88诱导BALB/c小鼠空肠损伤的机制研究[J]."中国畜牧杂志，"2021，"57（11）："213–216.

[16] 尉冰."灵芝多糖对小鼠实验性溃疡性结肠炎的免疫调节作用的研究[D]."沈阳："中国医科大学，"2018.

[17] HEXIN"W，"XIAOFENG"Z，"QINGQING"L，"et"al."Ruscogenins"improve"CD-like"enteritis"by"inhibiting"apoptosis"of"intestinal"epithelial"cells"and"activating"Nrf2/NQO1"pathway[J]."Oxidat"Med"Cell"Longev，"2022，"2022："4877275.