单细胞RNA测序和孟德尔随机化分析IgA肾病关键基因的调控作用

[摘要]"目的"探讨IgA肾病（IgA"nephropathy，IgAN）中重点细胞类型的基因表达及关键基因ADI1、BNIP3L、SERPINE2对IgAN发生、发展的调控作用。方法"采用基因表达综合数据库（gene"expression"omnibus，GEO）和eQTLGen联盟数据库，通过孟德尔随机化（mendelian"randomization，MR）和单细胞RNA测序（single-cell"gene"expression，scRNA-seq），探讨IgAN的关键细胞类型及ADI1、BNIP3L、SERPINE2与IgAN间的因果关系。使用Seurat软件包读取表达谱并筛选低表达基因，通过差异基因表达分析筛选TOP100高表达基因，采用敏感性分析和异质性检验选择显著的基因结果。最后，通过重要基因的调控网络分析和微小核糖核酸（microRNA，miRNA）网络构建对MR结果进行验证。结果"ADI1（OR=0.946，95%CI：0.900～0.994，P=0.029）、BNIP3L（OR=0.820，95%CI：0.707～0.950，P=0.008）、SERPINE2（OR=0.958，95%CI：0.919～0.999，P=0.045）可能与IgAN风险降低相关。KLF6（OR=1.318，95%CI：1.036～1.678，P=0.025）与IgAN的风险升高相关。结论"揭示包括近端肾小管细胞在内的18种关键细胞类型的基因特征，确定ADI1、BNIP3L、SERPINE2与IgAN发生、发展的调控作用密切相关。

[关键词]"单细胞RNA测序；孟德尔随机化；IgA肾病；关键基因；慢性肾病

[中图分类号]"R692.5"""""""[文献标识码]"A""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.35.002

Single-cell"RNA"sequencing"and"Mendelian"randomization"to"analyze"regulatory"role"of"key"genes"in"IgA"nephropathy

QIU"Minhua1，2，"JIANG"Peng2，3，"CHEN"Jibing2，3，"ZHANG"Ting2，3，"GAO"Hongjun2，3

1.Graduate"School"of"Guangxi"University"of"Traditional"Chinese"Medicine，"Nanning"530001，"Guangxi，"China;"2.Department"of"Organ"Transplantation，"Ruikang"Hospital"Affiliated"to"Guangxi"University"of"Traditional"Chinese"Medicine，"Nanning"530011，"Guangxi，"China;"3.Clinical"Translational"Medicine"Center，"Ruikang"Hospital"Affiliated"to"Guangxi"University"of"Traditional"Chinese"Medicine，"Nanning"530011，"Guangxi，"China

[Abstract]"Objective"To"explore"gene"expression"of"key"cell"types"in"IgA"nephropathy"（IgAN）"and"regulatory"role"of"key"genes"ADI1，"BNIP3L"and"SERPINE2"in"occurrence"and"development"of"IgAN."Methods"The"gene"expression"omnibus"（GEO）"and"eQTLGen"consortium"database"were"used"to"perform"Mendelian"randomization"（MR）"and"single-cell"RNA"sequencing"（scRNA-seq）."Key"cell"types"of"IgAN"and"causal"relationship"between"ADI1，"BNIP3L，"SERPINE2"and"IgAN"were"investigated."Expression"profiles"and"screened"out"low"expression"genes"were"read"through"Seurat"package，"and"used"differential"gene"expression"analysis"to"screen"TOP100"highly"expressed"genes."In"addition，"were"used"sensitivity"analysis"and"heterogeneity"test"were"used"to"select"significant"results."Results"ADI1"（OR=0.946，"95%CI："0.900–0.994，"P=0.029），"BNIP3L"（OR=0.820，"95%CI："0.707–0.950，"P=0.008），"SERPINE2"（OR=0.958，"95%CI："0.919–0.999，"P=0.045）"might"be"associated"with"a"lower"risk"of"IgAN."However，"KLF6"（OR=1.318，"95%CI："1.036–1.678，"P=0.025）"was"associated"with"high"risk"of"IgAN."Conclusion"Genetic"characteristics"of"18"key"cell"types"including"proximal"renal"tubule"cells"were"revealed.ADI1，"BNIP3L"and"SERPINE2"are"closely"related"to"the"regulation"of"IgAN.

[Key"words]"Single-cell"RNA"sequencing;"Mendelian"randomization;"IgA"nephropathy;"Key"genes;"Chronic"kidney"disease

IgA肾病（IgA"nephropathy，IgAN）是最常见的原发性肾小球肾炎，其主要机制是IgAN在内的免疫复合物存在于肾小球系膜中，引起一系列炎症反应，导致患者进展为心血管疾病死亡和终末期肾病（end-stage"renal"disease，ESRD）[1]。识别可改变的危险因素对预防IgAN进展和提高治疗效果具有重要意义。近年来，利用单细胞RNA测序技术的研究表明，IgAN患者外周血中B2亚群细胞数明显增加[2]。T细胞失衡可导致B细胞产生过多异常的IgA。幼稚CD4+T细胞分化为辅助性T细胞，分泌并产生各种细胞因子如白细胞介素（interleukin，IL）-17a、IL-17f和IL-22，使炎症细胞进一步浸润肾组织，加重IgAN损伤[3]。研究表明免疫细胞特征与IgAN间存在很强的关联性[4]。孟德尔随机化（Mendelian"randomization，MR）是一种用于因果推理的流行病学方法，其中与暴露因素密切相关的遗传变异被用作工具变量[5-6]。MR的功能类似于随机对照试验，因为基因型在减数分裂期间是随机分配的，可限制混杂因素的影响和反向因果关系[7-8]。本研究采用单细胞RNA测序（single-cell"gene"expression，scRNA-seq）和MR方法探讨IgAN的重点细胞类型和基因表达，分析与IgAN发生、发展相关的重点基因间的遗传关系和因果关系，以证实免疫、信号和代谢通路在IgAN发病机制中的重要作用。

1""资料与方法

1.1""数据获取

从基因表达综合数据库（gene"expression"omnibus，GEO）[9]下载GSE171314单细胞数据文件，下载5例带有完整单细胞表达谱的样本数据用于单细胞分析。eQTL数据来自eQTLGen联盟（https：//www."egtlgen.org）数据库。本研究选择全基因组关联研究数据库。结局汇总数据来源于欧洲生物信息学研究所数据库。其中，IgAN病例有15"587例和对照""462"197例。

1.2""scRNA-seq

首先通过Seurat包读取表达谱并筛除低表达基因，依次对数据进行标准化分析处理，通过ElbowPlot观察最佳主成分（principal"component，PC）数，通过UMAP分析得到每个cluster间的位置关系；通过已知的细胞标志物对cluster进行注释，分别被注释到一些与疾病发生有重要关系的细胞。最后从单细胞表达谱中提取每个细胞亚型的标记基因。筛选其中log2"FCgt;0.585且P_adjlt;0.05的基因作为每个细胞亚型中的特有标记基因。进行差异基因表达分析筛选对照vs.疾病的TOP100高表达基因，将其作为cluster的特征基因并计算这些基因在每个细胞亚型中的差异表达水平和表达占比，最后计算疾病贡献度。

1.3""MR与调控网络分析

提取在eQTL中的相关因果关系，选择与每个基因在全基因组显著性阈值相关的单核苷酸多态性（single"nucleotide"polymorphism，SNPs）作为潜在的工具变量，计算SNPs间的连锁不平衡。依次通过逆方差加权、MR"Egger、加权中位数法估计、加权模型估计4种统计方法评估因果关系的可靠性，获得全血基因表达对IgA肾病影响的总体估计。运用MR留一法敏感性分析评估特定遗传变异对胶质瘤风险的影响。采用MR异质性检验评估所研究的SNPs间是否存在统计异质性。通过R软件包“RcisTarget”预测转录因子。进一步分析在关键基因中是否有部分miRNAs调节一些危险基因的转录或降解。

2""结果

2.1""数据下载及scRNA-seq结果

下载GSE171314单细胞数据，共纳入5例样本，在初步筛选之后，标准差最高的10个基因分别是KLK1、1L1RL1、CCL4L2、CCL3L1、NPHS2、CCL4、S100A9、CCL3、S100A8、RGS5。通过对10个基因进行分析获得18个亚群，可归类为11种细胞类型，即循环细胞、平滑肌细胞、单核吞噬细胞、间质细胞、主细胞、亨利氏细胞环、远端肾小管细胞、近端肾小管细胞、吞噬细胞、内皮细胞和系膜细胞。通过筛选总样本中对照vs.疾病的TOP100高表达基因，计算疾病贡献度发现近端肾小管上皮细胞的贡献度最高，因此将近端肾小管上皮细胞作为后续分析的关键细胞，筛选其中log2FCgt;0.585且P_adjlt;0.05的基因，共获得328个细胞基因。

2.2""MR分析、敏感性分析和异质性分析

为进一步找出影响IgAN的关键基因，通过IgAN相关的477"784例样本，依次使用提取仪器和提取数据提取到232对基因与结局相关的因果关系。进一步通过MR筛选得到4对基因对应eQTL阳性结局，对应4个基因依次是ADI1、BNIP3L、KLF6、SERPINE2。ADI1（OR=0.946，95%CI：0.900～"0.994，P=0.029）、BNIP3L（OR=0.820，95%CI：0.707～"0.950，P=0.008）、SERPINE2（OR=0.958，95%CI：0.919～0.999，P=0.045）的存在可能与IgAN的低风险相关；而基因KLF6（OR=1.318，95%CI：1.036～"1.678，P=0.025）与IgAN的高风险相关。进一步对4个基因的因果关系进行敏感性分析确定其可靠性。结果显示剔除任何一个SNP后对总体误差线的影响并不明显。此外，对4对因果关系进行异质性分析，将3个异质性检验Pgt;0.05的基因作为后续分析的关键基因。这些关键基因分别是ADI1、BNIP3L、SERPINE2。

2.3""关键基因的scRNA-seq分析及免疫代谢通路富集分析

采用scRNA-seq方法分析关键基因在肾小球系膜细胞、内皮细胞、吞噬细胞、近端肾小管细胞、远端肾小管细胞、细胞环、主细胞、间插细胞、单核吞噬细胞、平滑肌细胞、循环细胞中的表达情况。将ADI1、BNIP3L、SERPINE2关键基因用于本次分析的基因集，关键基因所有富集到的Motifs和相应的转录因子见图1。通过miR-Walk数据库对3个关键基因进行反向预测，得到42个miRNA，共43对mRNA-miRNA关系见图2。

3""讨论

IgAN是世界范围内最常见的原发性肾小球肾炎，占ESRD的概率为20%～40%，其高发病率和高死亡率给社会和经济带来巨大的负担。IgAN的病理生理机制尚未完全阐明。侵入性肾活检是目前唯一可用的识别IgAN的工具，目前的治疗方法在临床中尚未达到预期疗效。因此，迫切需要在充分了解发病机制的基础上开发新的非侵入性方法和更有效的治疗方案[11]。本研究采用scRNA-seq方法在GSE171314单细胞数据中纳入5例单细胞数据样本，通过计算得出近端肾小管上皮细胞与10个基因的丰度密切相关，并通过近端肾小管上皮细胞筛选出328个细胞基因。Perry等[12]研究表明，肾小管上皮细胞中的巨噬细胞集落刺激因子主要通过与其受体基因结合并促进肾小管细胞增殖保护急性肾损伤。本研究结果表明SLC12A3在IgAN发生和发展中有潜在作用。SLC12A3是一种基因编码钠-氯化物协同转运蛋白，可介导肾远曲小管中的Na和Cl重吸收，在肾脏疾病中具有遗传效应[13]。此外，SLC12A3"基因中的单核苷酸变异Arg913Gln与2型糖尿病患者的糖尿病肾病有关。本研究MR筛选得到4对基因对应eQTL阳性结局的因果关系。其中，ADI1、BNIP3L、SERPINE2的存在可能与IgAN低风险相关，而基因KLF6与IgAN高风险相关。进一步敏感度和特异性分析证实ADI1、BNIP3L、SERPINE2对IgAN均有良好的诊断性能。研究表明ADI1作为一个代谢相关基因，与巨噬细胞M2、中性粒细胞、树突状细胞活化呈正相关，与巨噬细胞M1、B淋巴细胞、T淋巴细胞CD4呈负相关[14]；侧面提示ADI1与抑制性免疫表型相关，而免疫系统的参与是IgAN的重要致病原因之一，证实ADI1的表达水平在IgAN患者中的意义。Pan等[15]研究发现BNIP3L与线粒体活性氧（reactive"oxygen"species，ROS）和线粒体自噬通路密切相关。BNIP3L参与控制血小板炎性小体活化，后者和线粒体功能障碍的扩增回路可减轻败血症相关急性肾损伤。Delgado等[16]研究证明，使用针对BNIP3L的反义寡核苷酸阻断缺氧诱导的BNIP3L表达或通过表达BNIP3L突变阻断"BNIP3L功能来抑制缺氧诱导的人胚胎肾293细胞的死亡。在人上皮细胞系中，缺氧介导的BNIP3L表达受转录因子缺氧诱导因子-1α的调节，在细胞死亡中发挥重要作用。SERPINE2是一种分泌蛋白，是纤溶酶原、尿激酶和凝血酶的抑制剂。研究表明SERPINE2表达与肿瘤发生和侵袭有关[17]。SERPINE2在晚期肾细胞癌组织中高表达，在瘤旁组织和HK-2细胞系中低表达。SERPINE2降低可显著抑制晚期肾细胞癌细胞的生长和侵袭，而SERPINE2过表达可显著促进晚期肾细胞癌细胞在体外和体内的转移[18]。另外，SERPINE2主要是凝血和纤溶相关基因，凝血和纤溶系统的异常激活可导致血栓形成和微循环障碍，从而进一步影响肾功能[19]。Gao等[20]研究表明KLF6通过与miR-223-3p启动子结合抑制miR-223-3p并促进NLRP3，并激活NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路，从而加重细胞焦亡和脓毒性急性肾损伤。Piret等[21]发现肾近端小管细胞代谢改变在急性肾损伤中起关键作用。KLF6在小鼠急性肾损伤后期的肾近端小管细胞中被诱导，在细胞色素C氧化酶2合成的转录激活中起作用，KLF6的缺失保留编码支链氨基酸（branched-chain"amino"acid，BCAA）基因表达，减轻急性肾损伤和最终的肾脏纤维化。相反，如果诱导小鼠KLF6过表达则抑制BCAA基因，这将造成肾损伤。此外，多种BCAA基因有KLF6结合位点，表明KLF6可能是BCAA分解代谢的转录调节因子。在脂肪酸氧化减少的肾损伤中，维持BCAA分解代谢可能提供一种替代的线粒体能量来源改善肾损伤。Zhang等[22]发现miR-181d-5p上调对肾脏急性肾缺血、再灌注损伤和因缺氧/复氧损伤的肾细胞产生保护性抗凋亡和抗炎作用，这些作用是通过靶向抑制KLF6实现的。另外，研究发现刺芒柄花素可显著改善肾功能并减少缺血性急性肾损伤的炎症反应，主要是通过抑制KLF6/STAT3介导的巨噬细胞实现的[23]。

本研究确定4个关键候选基因（ADI1、BNIP3L、KLF6和SERPINE2）可作为潜在的IgAN生物标志物。IgAN的组织病理学征象是含IgA的免疫复合物沉积到肾小球系膜引起的炎症反应，最终导致肾小球肾炎和肾功能障碍。但介导这一过程的机制尚不清楚。白细胞浸润是由组织释放化学引诱剂分子引发的，并因内皮细胞的稳态失衡而增强[24]。Zhou等[25]在IgAN肾小球内皮细胞中发现表达大量与内皮功能障碍相关的基因（dn1、F8和Nostrin）及促炎细胞因子（Cx3cl1、Cxcl1、Cxcl10、Cxcl16和Cxcl11）。另外，Watanabe等[26]先前已描述内皮附着分子1基因多态性与IgAN进展的相关性，这种关系靶向一种已确定的促炎细胞因子可能是治疗IgAN的选择。在肾小球内皮细胞中诱导主要组织相容性复合体Ⅰ类基因已被证明可促进T淋巴细胞向组织浸润，这可能反映IgAN相关肾小球病变的相同功能。本研究对3个关键基因ADI1、BNIP3L、SERPINE2进行调控网络分析和网络构建，量化免疫、信号和代谢通路的相关性，结果表明IgAN与氧化磷酸化、活性氧通路和雷帕霉素靶蛋白复合物1（mechanistic"target"of"rapamycin"complex"1，mTORC1）信号通路密切相关。Zhang等[27]研究表明Sesns是一类高度保守的应激反应蛋白家族，由P53和叉头转录因子通过转录调控，在体内表现出氧化还原酶活性，保护细胞免受氧化应激，目前已证明可减轻心脏、肝脏和肾脏的缺血再灌注损伤，其主要通过降低ROS水平和抑制mTORC1活性减轻应激反应。Wu等[28]研究发现多靶点酪氨酸激酶抑制剂卡博替尼和mTORC1/mTORC2抑制剂沙帕色替的联合用药可有效抑制肾细胞癌细胞外调节蛋白激酶信号通路磷酸化，从而降低下游转录因子及其参与细胞周期调控和凋亡的靶基因表达，这有效抑制肾细胞癌的进展。细胞内ROS水平的升高在慢性肾脏疾病的发病机制中起着重要作用[29]。细胞内ROS水平的增加可导致脂质、脱氧核糖核酸和蛋白质的氧化，从而导致细胞损伤。另一方面，ROS也是细胞信号传递中重要的次级信使。因此，正常的肾细胞功能依赖于适量的ROS。线粒体和NADPH氧化酶是肾脏中ROS的主要来源，但肾脏抗氧化系统如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶或谷胱甘肽过氧化物酶可抵消ROS介导的损伤。研究表明ROS-抗氧化系统的改变在慢性肾脏疾病中起主要作用[29-30]。由于ROS分子也是生理过程的一部分，很难精确定义其明确的致病机制。此外，ROS-抗氧化剂的水平可在许多肾脏疾病的不同病程中波动，包括IgAN。因此，为在最少不良反应下获得最佳治疗效果，关键是要选择有益于疾病细胞的时间或细胞位置进行靶向ROS。重要的是，必须调节抗氧化剂或促氧化剂的剂量以保持健康细胞所必需的氧化还原信号。通过提高对氧化还原调控的理解，可给IgAN治疗带来巨大的进步。

本研究还分析了BNIP3L和SERPINE2的基因集，发现这两个基因受MXI1、EMX2、PAX6、BHLHE41、EMX1GCM1、HSF1和HSF2转录因子共同机制的调控。本研究通过对ADI1、BNIP3L和SERPINE2进行反向预测，得到42个miRNA，共43对mRNA-miRNA关系对，这些转录因子和miRNA关系可能在IgAN的发展中发挥重要作用，并作为IgAN诊断和治疗的潜在候选分子靶点。

综上，本研究通过scRNA-seq揭示近端肾小管细胞在内的18个关键基因和基因特征在IgAN中的作用，为鉴定关键基因和通路提供参考。通过MR进一步分析ADI1、BNIP3L、SERPINE2与IgAN发生、发展的潜在因果关系，揭示其在免疫、信号和代谢通路中的相关性。这些发现可能对IgAN免疫抑制的治疗及其基因作为疾病风险评估的生物标志物的效能提供参考。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

[参考文献]

[1] REN"F，"JIN"Q，"LIU"T，"et"al."Causal"effects"between"gut"microbiota"and"IgA"nephropathy："A"bidirectional"Mendelian"randomization"study[J]."Front"Cell"Infect"Microbiol，"2023，"13："1171517.

[2] ZHANG"Y"M，"ZHOU"X"J，"SHI"S"F，"et"al."Homocysteine"and"IgA"nephropathy："Observational"and"Mendelian"randomization"analyses[J]."Chin"Med"J"（Engl），"2020，"133（3）："277–284.

[3] ZHENG"Y，"LU"P，"DENG"Y，"et"al."Single-cell"transcriptomics"reveal"immune"mechanisms"of"the"onset"and"progression"of"IgA"nephropathy[J]."Cell"Rep，"2020，"33（12）："108525.

[4] TAN"S，"PAN"S，"WEI"L，"et"al."Association"of"peripheral"B"cells"and"delirium："Combined"single-cell"sequencing"and"Mendelian"randomization"analysis[J]."Front"Neurol，"2024，"15："1343726.

[5] YANG"S，"GUO"J，"KONG"Z，"et"al."Causal"effects"of"gut"microbiota"on"sepsis"and"sepsis-related"death："Insights"from"genome-wide"Mendelian"randomization，"single-cell"RNA，"bulk"RNA"sequencing，"and"network"pharmacology[J]."J"Transl"Med，"2024，"22（1）："10.

[6] YU"Z，"LV"Y，"SU"C，"et"al."Integrative"single-cell"analysis"reveals"transcriptional"and"epigenetic"regulatory"features"of"clear"cell"renal"cell"carcinoma[J]."Cancer"Res，"2023，"83（5）："700–719.

[7] DOKE"T，"ABEDINI"A，"AIDRIDGE"D"L，"et"al."Single-cell"analysis"identifies"the"interaction"of"altered"renal"tubules"with"basophils"orchestrating"kidney"fibrosis[J]."Nat"Immunol，"2022，"23（6）："947–959.

[8] MUHI"L，"GENOVE"G，"LEPTIDIS"S，"et"al."Single-cell"analysis"uncovers"fibroblast"heterogeneity"and"criteria"for"fibroblast"and"mural"cell"identification"and"discrimination[J]."Nat"Commun，"2020，"11（1）："3953.

[9] SHI"T，"BURG"A"R，"CALDWELL"J"T，"et"al."Single-cell"transcriptomic"analysis"of"renal"allograft"rejection"reveals"insights"into"intragraft"TCR"clonality[J]."J"Clin"Invest，"2023，"133（14）："e170191.

[10] ZHENG"J，"ZHANG"Y，"RASHEED"H，"et"al."Trans-ethnic"Mendelian-randomization"study"reveals"causal"relationships"between"cardiometabolic"factors"and"chronic"kidney"disease[J]."Int"J"Epidemiol，"2022，"50（6）："1995–2010.

[11] STAMELLOU"E，"SEIKRIT"C，"TANGS"C"W，"et"al."IgA"nephropathy[J]."Nat"Rev"Dis"Primers，"2023，"9（1）："67.

[12] PERRY"H，"OKUSA"M."Driving"change："Kidney"proximal"tubule"CSF-1"polarizes"macrophages[J]."Kidney"Int，"2015，"88（6）："1219–1221.

[13] LI"N，"GU"H"F."Geneticnbsp;and"biological"effects"of"SLC12A3，"a"sodium-chloride"cotransporter，"in"citelman"syndrome"and"diabetic"kidney"disease[J]."Front"Genet，"2022，"13："799224.

[14] ZHANG"H，"HU"J，"ZHU"J，"et"al."Machine"learning-based"metabolism-related"genes"signature"and"immune"infiltration"landscape"in"diabetic"nephropathy[J]."Front"Endocrinol"（Lausanne）"，"2022，"13："1026938.

[15] PAN"P，"CHEN"J，"XIE"F，"et"al."Enhancing"Nix-dependent"mitophagy"relieves"AKI"by"restricting"TREM-1-mediated"hyperactivation"of"inflammasome"in"platelets[J]."FASEB"J，"2023，"37（11）："e23239.

[16] DELGADO"J"M，"SHEPARD"L"W，"LAMSON"S"W，"et"al."The"ER"membrane"protein"complex"restricts"mitophagy"by"controlling"BNIP3"turnover[J]."EMBO"J，"2024，"43（1）："32–60.

[17] ZHANG"J，"LUO"A，"HUANG"F，"et"al."SERPINE2"promotes"esophageal"squamous"cell"carcinoma"metastasis"by"activating"BMP4[J]."Cancer"Lett，"2020，"469："390–398.