甲基转移酶样3调节食管鳞癌细胞功能的研究

[摘" "要]" "目的：探究甲基转移酶样3（methyltransferase-like 3， METTL3）在食管鳞癌中的表达水平和作用机制。方法：体外构建食管鳞癌细胞Eca-109的METTL3敲低模型，利用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR， qRT-PCR）、Western Blot验证敲低水平，检测肿瘤细胞的增殖、迁移能力。利用差异分析、富集分析以及生存分析等寻找METTL3的靶基因。结果：敲低METTL3可以显著抑制食管癌细胞的增殖和迁移能力；利用生物信息学分析寻找到受METTL3调控的9个可能的靶基因（精脒/精胺N1-乙酰基转移酶1（spermidine/spermine N1-acetyltransferase 1， SAT1）、低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor， LDLR）、整合素β1（integrin subunit beta 1， ITGB1）、细胞间黏附分子5（intercellular adhesion molecule 5， ICAM5）、富含谷氨酸的WD重复序列蛋白1（glutamate-rich WD40 repeat containing 1， GRWD1）、含纤维连接蛋白Ⅲ型结构域3A 蛋白（fibronectintype-Ⅲ domain-containing protein 3A， FNDC3A）、DnaJ热休克蛋白家族成员C2[DnaJ heat shock protein family（Hsp40） member C2， DNAJC2]、卷曲螺旋域蛋白88C（coiled-coil domain containing 88C， CCDC88C）、Rho GTP酶激活蛋白12（Rho GTPase activating protein 12， ARHGAP12），其中SAT1高表达与食管鳞癌患者预后不良密切相关，差异有统计学意义。结论：METTL3在食管鳞癌中发挥促癌作用，可能通过调控SAT1等靶基因的m6A甲基化影响食管鳞癌患者的预后。

[关键字]" "食管鳞癌；甲基转移酶样3；细胞增殖；生存分析

[中图分类号]" "R735.1" " " " " " " "[文献标志码]" "A" " " " " " " "[文章编号]" "1674-7887（2024）02-0101-06

Study on the function of methyltransferase-like 3 in regulating esophageal squamous cell carcinoma cells*

XIONG Jiashi1**， JI Pengxiang2， WANG Junjie2， HE Gang3***" " " " （1Department of Oncology， Shanghai Fengxian District Central Hospital， Shanghai 201499; 2Department of Biochemistry and Molecular Biology， Medical College， Soochow University; 3Department of Thoracic Surgery， Shanghai Fengxian District Central Hospital）

[Abstract]" "Objective： To explore the expression levels and mechanisms of methyltransferase-like 3（METTL3） in esophageal squamous cell carcinoma. Methods： In vitro construction of METTL3 knockdown model in Eca-109， validated by quantitative real-time PCR（qRT-PCR） and Western Blot to confirm knockdown levels， and assessment of tumor cell proliferation and migration abilities. Exploring METTL3 target genes through differential analysis， enrichment analysis， and survival analysis. Results： Knocking down METTL3 significantly inhibits the proliferation and migration abilities of esophageal cancer cells. Through bioinformatics analysis， we identified 9 potential target genes regulated by METTL3 spermidine/spermine N1-acetyltransferase 1（SAT1）， low density lipoprotein receptor（LDLR）， integrin subunit beta 1（ITGB1）， intercellular adhesion molecule 5（ICAM5）， glutamate-rich WD40 repeat containing 1（GRWD1）， fibronectintype-Ⅲ domain-containing protein 3A（FNDC3A）， DnaJ heat shock protein family（Hsp40） member C2（DNAJC2）， coiled-coil domain containing 88C（CCDC88C）， Rho GTPase activating protein 12（ARHGAP12）. High expression of SAT1 is closely associated with poor prognosis in esophageal squamous cell carcinoma patients. Conclusions： METTL3 exerts a pro-cancer role in esophageal squamous cell carcinoma， potentially impacting the prognosis of esophageal squamous cell carcinoma patients by regulating m6A methylation of target genes such as SAT1.

[Key words]" "esophageal squamous cell carcinoma; methyltransferase like-3; cell proliferation; survival analysis

食管癌是全球范围内高发病、高转移的消化道恶性肿瘤。由于食管癌侵袭性强，发病机制复杂[1]，患者发现时往往已达晚期，且诊断方式、治疗技术的局限性导致患者生存率较低[2-4]。因此深入探究食管癌的发生发展机制对其临床治疗及诊断具有重要意义。

甲基转移酶样3（methyltransferase like-3， METTL3）是甲基转移酶样基因家族成员之一，可与甲基转移酶样14（methyltransferase like-14， METTL14）以及肾母细胞瘤1关联蛋白（recombinant Wilms tumor 1 associated protein， WTAP）等形成多组分甲基转移酶复合物，它可在mRNA和ncRNA的腺嘌呤碱基的第6位氮原子上添加1个甲基形成N6-甲基腺嘌呤[5]。目前已有多项研究[6-7]表明METTL3在肿瘤发生发展过程中扮演着重要的角色，在肝癌、乳腺癌等中METTL3可促进肿瘤的发展进程。在食管癌中，有研究[8]表明METTL3与多种免疫细胞相关，可作为潜在的免疫治疗生物标志物，但其研究不多，涉及的信号通路复杂，因此探究METTL3在食管鳞癌中发挥的生物学作用，寻找其调控靶基因的分子机制，可以对食管鳞癌的临床治疗提供新的思路和理论依据。

1" "材料和方法

1.1" "Eca-109细胞株培养和shRNA转染" "人食管鳞癌细胞株Eca-109，购自中国科学院上海生命科学研究院——细胞资源中心，使用RPMI 1640完全培养基（含10%胎牛血清、10 U/mL 青霉素-链霉素双抗）进行培养。细胞培养箱内环境设置为37 ℃，5%CO2。利用https：//www.sigmaaldrich.com设计METTL3的shRNA序列（shMETTL3-1-F：CCGGGCCAAGGA-ACAATCCATTGTTCTCGAGAACAATGGATTGTTCC-TTGGCTTTTTG；shMETTL3-1-R：AATTCAAAAAG-CCAAGGAACAATCCATTGTTCTCGAGAACAATGG-ATTGTTCCTTGGC；shMETTL3-2-F：CCGGCGTCA-GTATCTTGGGCAAGTTCTCGAGAACTTGCCCAAG-ATACTGACGTTTTTG；shMETTL3-2-R：AATTCAA-AAACGTCAGTATCTTGGGCAAGTTCTCGAGAACT-TGCCCAAGATACTGACG；shNC-F：CCGGCAACAAGATGAAGAGCACCAACTCGAGTTGGTGCTCTTCA-TCTTGTTGTTTTTG；shNC-R：AATTCAAAAACAAC-AAGATGAAGAGCACCAACTCGAGTTGGTGCTCTT-CATCTTGTTG）。使用PEI（翌圣生物）转染试剂在Eca-109细胞中转染shNC与shMETTL3。

1.2" "RNA逆转录与实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR， qRT-PCR）" "使用TRIZOL（诺唯赞）法抽提RNA并测定RNA浓度。根据Vazyme公司的HiScriptⅡQ Select RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）试剂盒说明书，配置RNA终质量浓度为15 ng/μL，总体积为20 μL的反转录体系进行RNA逆转。利用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）设计定量引物（METTL3-F：CCAGGGTCTGGATTGTGATGT； METTL3-R：AGGGTGATCCAGTTGGGTTG；ACTB-F：GAAAATCTGGCACCACACCT；ACTB-R：ATAGCA-CAGCCTGGATAGCAA），以ACTB为内参。采用Vazyme公司的AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒进行实时荧光定量PCR检测METTL3基因在对照组和shRNA敲低组的食管癌细胞中的mRNA水平，采用相对定量分析方法，通过2-ΔΔCT计算目的基因相对于内参基因ACTB的表达量。

1.3" "蛋白质免疫印迹" "使用Western及IP裂解液（碧云天）裂解细胞，并通过BCA检测试剂盒（弗德生物）对蛋白定量。将蛋白样品与5×loading buffer混匀后100 ℃下变性10 min，然后经过SDS-PAGE电泳分离蛋白质样品，并转移到PVDF膜上，使用含有5%脱脂奶粉的1×TBST进行封闭。使用anti-METTL3与anti-β-actin一抗4 ℃孵育16 h后，再使用同源二抗室温孵育2 h。均匀滴加适量超敏ECL发光液于膜上，使用gensens 2000成像系统（Clinx）进行成像。

1.4" "细胞增殖" "在96孔板中接种细胞，使每孔细胞密度为1 000个/100 μL，细胞贴壁后在每孔中加入10 μL CCK-8溶液，于细胞培养箱中孵育2 h。孵育2 h后使用酶标仪测定每孔450 nm吸光度作为第0天的数据，随后每隔24 h进行数据测量。使用Graphpad Prism软件，以细胞培养时间为横轴、OD450 nm值为纵轴绘制细胞生长曲线。

1.5" "细胞克隆" "在12孔板中接种细胞，每孔细胞密度为500个/mL，细胞分散均匀，于培养箱中培养，每隔3 d更换1次新鲜培养基，根据生长情况连续培养1～2周。待细胞克隆生长至一定大小后，使用结晶紫染色细胞，拍照计数，结果分析。

1.6" "细胞迁移" "在Transwell上室中加入200 μL混合均匀的细胞悬液，每个小室内细胞个数为5×104个，细胞培养箱中培养24 h。甲醇固定、结晶紫染色，用棉签轻轻擦掉上室中残留的液体。显微镜下拍照、计数。

1.7" "生信分析" "从GEO数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载与METTL3敲低相关的基因表达谱数据集GSE 179267。将样本分成正常对照组和METTL3敲低组，通过R软件中“Limma”程序包，设定条件|log2FC|gt;1且Plt;0.05获取差异表达基因（differentially expressed genes， DEGs），以用于后续火山图的绘制，以及进一步的分析鉴定表达差异显著的基因。M6A2Target（http：//m6a2target.canceromics.org/）是一个m6A调节因子的靶基因数据库，通过下载其提供的m6A调节因子靶标数据，分析寻找受METTL3调控的靶基因。利用整合基因本体（Gene Ontology， GO）、京都基因和基因组大百科全书数据库（Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）、UniProt以及DrugBank等多个权威数据库资源的metascape数据库（https：//metascape.org/）进行基因功能富集分析。下载TCGA数据库中食管鳞癌RNA-seq数据和相应临床信息数据，使用“survival”、“survminer”等R包对相关基因进行生存分析及绘制生存曲线。

2" "结" " " 果

2.1" "METTL3对细胞增殖、迁移等生物学功能的影响" "为检测METTL3基因在食管鳞癌细胞中发挥的作用，构建了METTL3敲降的载体，瞬时转染Eca-109细胞并对其敲降效率进行检测，发现转染shRNA后METTL3的mRNA和蛋白表达水平显著下降（图1A～B）。在此基础上，通过CCK-8实验分析了METTL3基因对食管鳞癌细胞增殖能力的影响，结果发现：敲降METTL3基因能显著抑制食管鳞癌细胞的增殖能力（Plt;0.01）。Transwell实验观察了食管鳞癌细胞在敲低METTL3前后体外迁移能力，结果表明METTL3敲降后，食管鳞癌细胞体外迁移能力受到显著抑制（图2）。

2.2" "DEGs的鉴定及METTL3靶基因的寻找" "对数据集GSE 179267进行差异分析，得到180个DEGs，其中包括58个上调基因和122个下调基因（|log2FC|gt;1，Plt;0.05）。利用DEGs的分析结果绘制火山图，其中红色代表上调基因，绿色代表下调基因（图3A）。通过m6A2Target数据库筛选受METTL3调控的靶基因，并与上述差异基因取交集，共得96个候选基因（图3B）。

2.3" "富集分析" "通过Metascape数据库对上述96个候选靶基因进行功能及通路富集分析（图4）。结果显示主要与对Ⅰ型干扰素的反应、血管发育、免疫系统细胞因子信号、白细胞聚集以及调控蛋白复合物的组装等相关。这些功能和通路在癌症的发生发展中发挥重要作用。

2.4" "生存分析" "利用 “survminer”以及“survival”包的Survfit函数对候选靶基因进行生存分析，发现9个基因与食管鳞癌患者生存显著相关（图5）：精脒/精胺N1-乙酰基转移酶1（spermidine/spermine N1-acetyltransferase 1， SAT1）、低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor， LDLR）、整合素β1（integrin subunit beta 1， ITGB1）、细胞间黏附分5（intercellular adhesion molecule 5， ICAM5）、富含谷氨酸的WD重复序列蛋白1（glutamate-rich WD40 repeat containing 1， GRWD1）、含纤维连接蛋白Ⅲ型结构域3A 蛋白（fibronectintype-Ⅲ domain-containing protein 3A， FNDC3A）、DnaJ热休克蛋白家族成员C2[DnaJ heat shock protein family（Hsp40） member C2， DNAJC2]、卷曲螺旋域蛋白88C（coiled-coil domain containing 88C， CCDC88C）、Rho GTP酶激活蛋白12（Rho GTPase activating protein12， ARHGAP12）。其中LDLR、ITGB1、ICAM5、GRWD1、FNDC3A、DNAJC2、CCDC88C、ARHGAP12的低表达提示食管鳞癌预后不良；而SAT1的高表达与食管鳞癌患者的预后不良显著相关。

3" "讨" " " 论

食管鳞癌是全球范围内高发病、高转移的消化道恶性肿瘤，恶性程度高，发病机制复杂，严重危害国民健康水平[9]。因此，探索食管鳞癌发生发展的分子机制显得尤为重要。近年来，越来越多的研究[10-13]表明，m6A甲基化修饰相关的酶在肝癌、结直肠癌、肺癌、胃癌等多种癌症中均发挥着重要作用，它们可通过调控靶基因的mRNA的可变剪接、稳定性以及出入核等方式影响靶基因的翻译效率，从而影响肿瘤的发生发展。METTL3是m6A甲基转移酶复合物的关键组成部分，可以通过在特定RNA转录本的m6A甲基化影响RNA的稳定性和翻译效率。多项研究[14-16]表明METTL3在乳腺癌、肝癌、胶质母细胞瘤等多种癌症中均起到关键作用。然而，目前在食管鳞癌中受METTL3 m6A修饰的靶基因以及涉及的信号通路尚不明确。因此，寻找食管鳞癌中受METTL3调控的靶基因及相关信号通路，可能为食管鳞癌的诊断及治疗提供新的思路。

本研究采用体外细胞生物学实验对METTL3在食管鳞癌细胞中的生物学效应进行验证，证实METTL3在食管鳞癌中发挥促癌活性。在食管鳞癌细胞Eca-109中敲降METTL3基因可显著抑制其增殖和迁移能力。利用差异分析、富集分析以及生存分析等方法找到9个可能的靶基因（SAT1、ARHGAP12、CCDC88C、DNAJC2、LDLR、ITGB1、ICAM5、GRWD1、FNDC3A），其中SAT1高表达提示食管鳞癌患者预后不良，RHGAP、CCDC88C、DNAJC2、LDLR、ITGB1、ICAM5、GRWD1和FNDC3A基因低表达提示预后不良。富集分析结果显示，ARHGAP12、CCDC88C、ICAM5以及FNDC3A在影响白细胞聚集方面发挥作用，而白细胞的异常聚集则对肿瘤细胞的发生发展产生重要影响。目前已有多篇研究[17-20]报道ITGB1与食管癌的发生发展有着密切关联，而SAT1、ARHGAP12、LDLR以及FNDC3A等基因则在结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌等多种癌症中发挥重要作用。由此可见，上述基因在食管鳞癌的发生发展中可能扮演着重要的角色。

然而，本研究也有一些局限性，对m6A靶基因的生物学功能也有待进一步探究。未来将进一步挖掘相关数据，并结合本研究的结论，对筛选到的相关靶基因进行实验验证，以确定其是否可以作为新的METTL3靶点，为食管鳞癌的临床诊治提供理论依据。

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[收稿日期] 2023-12-01