基于痰标本的快速筛查方法在初诊疑似肺结核患者诊断中的临床应用

【摘要】 目的 探讨基于痰标本的快速筛查方法在初诊疑似肺结核患者诊断中的临床应用。

方法 选取2020年1月—2021年9月来广西胸科医院就诊的初诊疑似肺结核患者936例，收集所有患者痰标本分别进行痰涂片、固体培养和恒温扩增荧光法（简称“恒温扩增法”）检测，经筛选排除得到符合条件的病例共880例。对恒温扩增法、涂片和固体培养的灵敏度、特异性进行比较；使用Kappa检验评估痰涂片镜检、固体培养和恒温扩增法的一致性。

结果 恒温扩增法的灵敏度（40.27%）高于涂片（32.74%）和固体培养（35.10%），差异有统计学意义（P＜0.05）；恒温扩增法的特异性（99.50%）略高于涂片和固体培养（98.02%，99.01%），但差异无统计学意义（P＞0.05）。恒温扩增法与涂片结果总体一致率为89.32%（786/880），与固体培养结果总体一致率为81.36%（716/880）。Kappa检验一致性分析结果显示恒温扩增法与涂片结果高度一致（Kappa值=0.738，P＜0.001），与固体培养比较一致性中等（Kappa值=0.550，P＜0.001）。

结论 恒温扩增法用于初诊疑似肺结核患者诊断有着较高的灵敏度和特异性，与涂片法的结果一致性较好，具有快速检测、诊断的优势，可以在基层医院广泛推广应用。

【关键词】 恒温扩增法；涂片；固体培养；肺结核；Kappa分析；维恩图

中图分类号：R521 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2024.09.011

Clinical application of rapid screening method based on sputum specimens in the diagnosis of patients with suspected pulmonary tuberculosis at first diagnosis

ZHOU Youa， HE Xib， HUANG Lihuac， LIU Aimeid， SUI Wenxianc， HU Minc， YANG Xiaobinga▲

（a. Science and Education Biological Sample Library， b. Department of Thoracic and Cardiac Surgery， c. Department of Medical Laboratory， d. Office of President， Chest Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region， Liuzhou 545005， Guangxi， China）

【Abstract】 Objective To explore the clinical application of rapid screening method based on sputum specimens in the diagnosis of newly diagnosed patients with suspected pulmonary tuberculosis.

Methods A total of 936 newly diagnosed patients who visited Chest Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region from January 2020 to September 2021 were selected. Sputum samples of all patients were collected and detected by sputum smear， solid culture and thermostatic amplification fluorescence （hereinafter referred to as "thermostatic amplification"）. After screening and exclusion， a total of 880 eligible cases were identified. The sensitivity and specificity of isothermal amplification， smear and solid culture were compared and analyzed. Kappa test was used to evaluate the consistency of sputum smear microscopy， solid culture and thermostatic amplification.

Results The sensitivity of thermostatic amplification （40.27%） was higher than that of smear （32.74%） and solid culture （35.10%）， and difference was statistically significant （P<0.05）. The specificity of thermostatic amplification （99.50%） was slightly higher than that of smear （98.02%） and solid culture （99.01%）， but difference was not statistically significant （P>0.05）. The overall agreement rate of thermostatic amplification with smear results was 89.32% （786/880）， and that of thermostatic amplification with solid culture results was 81.36% （716/880）. The consistency analysis of Kappa test showed that the thermostatic amplification method was highly consistent with the smear results （Kappa value =0.738， P<0.001）， and the results showed moderate consistency with solid culture （Kappa =0.550， P<0.001）.

Conclusion Thermostatic amplification method has high sensitivity and specificity in the diagnosis of newly diagnosed patients with suspected pulmonary tuberculosis， and has good consistency with the results of smear method. It has the advantages of rapid detection and diagnosis， and can be widely applied in primary hospitals.

【Keywords】 thermostatic amplification; smear; solid culture; tuberculosis; Kappa analysis; Venn diagram

结核病是由结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的慢性传染病。目前，结核病仍然是单一传染源致死的重要原因，在新冠肺炎大流行期间，由于受新冠肺炎疫情的影响结核病死亡数连续两年出现增加［1］，但是报告的结核病患者数却大幅度减少，说明未确诊和未治疗的结核病患者数有所增加。在传染病的防治过程中，快速、有效地发现并治疗传染病患者极其重要。传统的涂片人工显微镜检查操作繁琐，检出率低，应对批量筛查费时费力；结核分枝杆菌培养一直被视为结核病诊断的“金标准”，但是结核培养物的周转时间非常长，对实验环境要求较高［2］，又容易受到污染、阳性培养物无法区分结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌而引起假阳性结果，从而延误疾病的诊断和治疗，因此传统的检测方法根本无法满足人们对于结核病早发现、早治疗的迫切需求。环介导等温扩增（LAMP）法是一种独特的DNA恒温扩增方式，TB-LAMP具有最少的实验室基础设施和生物安全要求，并且在一小时内就可出具检测报告，被世界卫生组织推荐作为一种快速的即时检测方法用于替代目前的痰涂片镜检诊断肺结核［3］。由于恒温扩增法简单、高效和可靠，目前已开发出多种方法用于病原微生物检测，成为近年来最受欢迎和首选技术之一［4］。本研究主要探讨恒温扩增法在初诊疑似肺结核患者诊断中的临床应用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2020年1月—2021年9月来广西胸科医院就诊的初诊患者，咳嗽、咳痰≥2周，或痰中带有血丝或咯血，肺部影像学有异常，疑似肺结核的患者936例，收集所有患者痰标本分别进行痰涂片、固体培养和恒温扩增荧光法（简称“恒温扩增法”）检测，经筛选排除得到符合条件的病例共880例，其中男性617例（70.11%），女性263例（29.89%），年龄16～89岁，年龄中位数57（47，68）岁。根据本研究采用的临床诊断标准，最终诊断为肺结核的患者678例；排除结核感染的患者202例，其中5例为艾滋病。痰固体培养241例阳性，采用噻吩-2羧酸肼（TCH）和对硝基苯甲酸（PNB）生长试验进行菌种鉴定，按照《分枝杆菌分离培养标准化操作程序及质量保证手册》［5］的标准，2例阳性培养物鉴定为非结核分枝杆菌（NTM）。本研究经过医院伦理委员会批准（伦理批号：2021-014），且所有患者均知情同意。

1.2 临床诊断标准

依据《肺结核诊断》（WS 288—2017）［6］，有肺结核患者接触史，咳嗽、咳痰≥2周，或痰中带血或咯血，发热、乏力、盗汗等结核中毒症状，具有肺结核影像学特征且至少满足以下1项或多项标准：（1）结核菌素皮肤试验呈中度或强阳性者（硬结平均直径≥10 mm，<15 mm为中度阳性；硬结平均直径≥15 mm或局部出现双圈、水疱、坏死及淋巴管炎者为强阳性）；（2）结核分枝杆菌γ-干扰素释放试验（IGRA）结果阳性者；（3）肺组织病理学检查结核分枝杆菌阳性；（4）抗酸染色涂片显微镜检查阳性或分枝杆菌培养阳性，菌种鉴定为结核分枝杆菌复合群或结核分枝杆菌核酸检测阳性者。

1.3 纳入与排除标准

（1）纳入标准（需同时满足以下条件）：①完成上述三项检测，相关诊断资料齐全的患者；②依据本研究临床诊断标准诊断为肺结核病或者排除肺结核病诊断的患者（诊断为除肺结核病以外的其他疾病）。（2）排除标准（满足以下其中任意一项者）：①曾确诊为结核病（包括肺结核和肺外结核）；②最终诊断为肺外结核者；③痰涂片、固体培养和恒温扩增荧光法任意一项结果不明确者；④诊断不明确者。

1.4 仪器与试剂

广州迪澳生物科技有限公司生产的Deaou 308C快速检测系统；宁波舜宇仪器有限公司生产的结核分枝杆菌FS400显微镜扫描系统；恒温扩增试剂、核酸提取或纯化试剂盒（T011S）购自广州迪澳生物科技有限公司；珠海贝索生物技术有限公司生产的金胺O染色液、中性罗氏培养基、抗酸染色液（萋尼氏法）、N-乙酰-L半胱氨酸-氢氧化钠（NALC-NaOH）混合溶液（等体积6%的NaOH溶液和2.9%的柠檬酸钠溶液混合，每100 mL混合溶液加入0.5 g NALC粉末溶解），pH值为6.8的磷酸盐缓冲液。

1.5 检测方法

1.5.1 涂片法

按照《痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》［7］中的标准操作程序执行，采用直接涂片法，随机使用金胺O染色液或抗酸染色液（萋尼氏法）染色，待染色完成后，使用FS400显微镜扫描系统自动阅片，再由人工镜检对阳性结果做进一步确认。

1.5.2 固体培养法

采用N-乙酰-L-半胱氨酸-氢氧化钠法对痰标本进行消化处理，并按照《结核病实验室检验规程》［8］中的标准操作程序执行。对生长菌落进行涂片、染色，确认是否为抗酸杆菌，并使用TCH和PNB生长试验进行菌种鉴定。

1.5.3 恒温扩增法

1.5.3.1 恒温扩增法原理

采用恒温扩增技术检测结核分枝杆菌复合群特异性片段（插入序列IS 6110）。其原理是利用具有链置换功能的Bst DNA聚合酶在恒定温度下启动链置换反应。扩增过程可分为启动阶段和循环扩增阶段，最终形成双链DNA混合物，扩增产物与核酸染料结合后发出荧光信号，荧光信号可由检测仪器捕获。

1.5.3.2 核酸扩增

用加样枪吸取2 μL核酸模板加入提前配置好的PCR反应体系中（密封液面以下）；在Deaou 308C快速检测系统上设置扩增程序63 ℃反应45 min，上机扩增，由仪器自动判读结果。

1.6 统计学方法

使用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析和处理，GraphPad Prism 8软件作图。非正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，计数资料采用χ2检验，检验水准α=0.05，双侧检验；使用Kappa检验评估痰涂片镜检、固体培养和恒温扩增法的一致性，Kappa值在0～0.20为极低一致性，0.21～0.40为一般一致性，0.41～0.60为中等一致性，0.61～0.80为高度一致性，0.81～1.00为几乎完全一致。

2 结 果

2.1 恒温扩增法与涂片、固体培养对比

以临床诊断为参考标准，恒温扩增法的灵敏度（40.27%）高于涂片（32.74%）和固体培养（35.10%），差异有统计学意义（χ2=359.411，P＜0.001；χ2=168.711，P＜0.001）；恒温扩增法特异性（99.50%）略高于涂片和固体培养（98.02%，99.01%），但比较差异无统计学意义（χ2=1.000，P＞0.05；χ2=1.000，P＞0.05）。Kappa检验一致性分析结果显示恒温扩增法与涂片结果高度一致（Kappa值=0.738，P＜0.001），和固体培养比较一致性中等（Kappa值=0.550，P＜0.001）。见表1和图1。

2.2 恒温扩增法与涂片、固体培养结果的维恩图分析

恒温扩增法与涂片结果总体一致率为89.32%（786/880），与固体培养结果总体一致率为81.36%（716/880）。在涂片阳性的222例肺结核中，恒温扩增法的灵敏度为91.44%（203/222），固体培养的灵敏度为73.42%（163/222）；在涂片阴性的456例肺结核中，恒温扩增法的灵敏度为15.35%（70/456），固体培养的灵敏度为16.45%（75/456）；在涂阳培阳的163例肺结核患者中，恒温扩增法检出144例（88.34%）；在381例涂阴培阴的肺结核患者中，恒温扩增法检测阳性39例。见图2。以固体培养为参考标准，恒温扩增法的灵敏度为73.53%（175/238），涂片的灵敏度为68.49%（163/238），差异有统计学意义（χ2=58.322，P＜0.001）；在培养阴性的440例肺结核中，恒温扩增法的灵敏度为22.27%（98/440），涂片的灵敏度为13.41%（59/440），差异有统计学意义（χ2=237.782，P＜0.001）。

3 讨 论

目前结核病的诊断主要还是依据病原学检查，但是在一些资源有限的落后地区，结核病诊断仍然不足［9］，影响结核病全球防控。传统的涂片和固体培养，虽然价格低廉，但是操作繁琐，而且固体培养需要2～8周才能得出结果。液体培养最快也需4天才能得出阳性报告，不能为临床提供时效性检测结果。2016年，世界卫生组织批准使用TB-LAMP代替涂片显微镜诊断结核病［3］。Xpert MTB/RIF等分子检测方法虽已被广泛应用于结核病诊断，但是费用相对更高［10-11］，对实验环境要求也更高［11］，从而限制了它们在基层医院的使用。本研究使用的恒温扩增荧光法具有标本用量较少（200 μL），实验操作简单、方便、快捷，报告时间短（1小时内）的优势。

王少华等［12］多中心研究结果显示，涂片、固体培养和恒温扩增的灵敏度为21.7%（300/1383）、34.9%（483/1383）、39.2%（542/1383），与本研究结果基本一致。本研究痰涂片的灵敏度（32.74%）高于王少华等［12］涂片结果，究其原因可能是本研究中使用显微镜扫描系统自动阅片提高了痰涂片的灵敏度；前期本科室的一项研究结果显示显微镜扫描系统自动阅片相比人工镜检可提高痰涂片的检出率（39.8% VS 25.6%）［13］，但同时也降低了特异性。本研究结果显示恒温扩增法特异性（99.50%）略高于涂片和固体培养（98.02%，99.01%）；在202例非结核病患者中，1例恒温扩增检出阳性，涂片、培养均为阴性，经查阅患者病历资料诊断为慢性肺炎，原因可能是本研究使用的恒温扩增法只能进行DNA检测，不能区分病原菌的死活，手工操作提取核酸存在污染的可能，因此DNA检验结果的解读应密切结合临床［14］；4例涂片检出阳性，其中2例培养阳性，恒温扩增法均为阴性，造成假阳性结果，阳性培养物经菌种鉴定为非结核分枝杆菌。以固体培养为参考标准，本研究中恒温扩增法的灵敏度为73.53%（175/238），在文献报道的58.94％～85.50％范围内［12，15-16］；涂片的灵敏度68.49%（163/238）低于恒温扩增法，说明恒温扩增法相比于涂片法用于初诊疑似肺结核患者诊断有着明显的优势。

恒温扩增法与涂片、固体培养结果总体一致率为89.32%、81.36%，在涂阳肺结核中，恒温扩增法、固体培养的灵敏度为91.44%、73.42%，Kappa检验一致性分析结果显示恒温扩增法与涂片结果高度一致（Kappa值=0.738，P＜0.001），与固体培养法一致性中等（Kappa值=0.550，P＜0.001），这与韩珍等［17］的研究结果基本一致（Kappa值=0.592，P<0.01）；说明恒温扩增法与涂片的结果一致性总体优于固体培养，这是因为培养只能进行活菌检测，而恒温扩增法和涂片不管死菌或活菌都能进行检测。在涂阳培阳的163例肺结核患者中，恒温扩增法检出144例（88.34%），剩余19例未检出的原因可能有以下几个方面：（1）部分患者痰量较少，只能分阶段留取痰标本用于检测，导致三种方法所检测的标本是同一患者在不同时间留取，影响了研究标本的一致性；（2）血液中的血红蛋白等成分会影响PCR反应扩增，有研究报道恒温扩增法检测血痰标本的灵敏度低于传统方法［16，18］ ；（3）恒温扩增法的取样量较少，实验操作中存在错过阳性部位的可能。在381例涂阴培阴的肺结核患者中，恒温扩增法仅检出39例（10.24%）阳性，是受限于患者排菌量和检测技术的局限性等因素，病原学阴性肺结核患者在总的肺结核患者中占较大比例［19］，并且痰涂片镜检在细菌量达到5000～10 000条/mL才会报告阳性［20］，培养法虽然灵敏度较高，但只能进行活菌检测，而恒温扩增法无论死菌活菌都可以检测。

综上所述，恒温扩增法是一种操作简便、快速筛查结核病的有效分子生物学方法，用于初诊疑似肺结核患者诊断有着较高的灵敏度和特异性，与涂片法结果的一致性较好，具有快速检测、诊断的优势。特别是对于一些无法提供较高专业知识和复杂操作技术的分子生物学检测方法的基层实验室［21］，恒温扩增法或许是一种较优的选择，它可以快速、准确地为临床提供筛查报告，便于及时发现和治疗结核病患者。有研究报道恒温扩增法对支气管肺泡灌洗液早期诊断肺结核［22］和结核性胸膜炎［23］也有很好的诊断效能。不足之处在于本研究是单中心研究，纳入的病例数还不够多，实验条件有待进一步优化，结果存在一定的局限性，今后还需扩大样本量和采用多中心研究对实验结果进一步验证。

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（收稿日期：2024-03-20 修回日期：2024-08-15）