不同生长期瓦尼桑黄和粗毛纤孔菌子实体主要活性成分含量比较

摘要 测定比较瓦尼桑黄和粗毛纤孔菌子实体不同产地及不同生长期粗多糖、总黄酮、总三萜、麦角甾醇的含量，结果表明，相同培养条件下，粗毛纤孔菌子实体在180 d采收时粗多糖含量最高，为4.52%；在60 d采收时总黄酮和麦角甾醇含量最高，分别为5.23和34.03 mg/kg；在30 d采收时总三萜含量最高，为0.61 mg/kg。3年生椴木栽培瓦尼桑黄子实体总三萜和麦角甾醇含量分别为0.17和5.86 mg/kg，显著高于1年生子实体总三萜和麦角甾醇含量（0.06和1.90 mg/kg）。综合比较，粗毛纤孔菌子实体活性成分含量优于瓦尼桑黄子实体。

关键词 粗毛纤孔菌；瓦尼桑黄；子实体；活性成分；含量比较；生长期

中图分类号 R 284 文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2024）20-0160-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.20.039

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Comparison of the Content of Main Active Components in the Fruiting Bodies of Sanghuangporus vaninii and Inonotus hispidus in Different Growth Stages

GAO Yang，LIU Hao，LIAO Fang-zhou et al

（Research Institute of Forestry and Pomology， Tianjin Academy of Agricultural Sciences， Tianjin 300384）

Abstract The content of crude polysaccharides， total flavonoids， total triterpenoids， and ergosterol in the fruiting bodies of Sanghuangporus vaninii and Inonotus hispidus in different origins and growth stages were measured and compared.The results showed that under the same cultivation conditions， the fruiting body of Inonotus hispidus had the highest crude polysaccharide content at 180 days of harvesting， which was 4.52%; at 60 days of harvesting， the total flavonoid and ergosterol contents were the highest， at 5.23 and 34.03 mg/kg， respectively; at 30 days of harvesting， the total triterpenoid content was the highest， at 0.61 mg/kg.The content of total triterpenes and ergosterol of fruiting bodies of Sanghuangporus vaninii cultivated by segment wood with 3 years were 0.17 and 5.86 mg/kg， respectively，which were significantly higher than those of 1 year fruiting body （0.06 and 1.90 mg/kg）.Overall， the content of active components of fruiting bodies of Inonotus hispidus was higher than that of Sanghuangporus vaninii.

Key words Inonotus hispidus;Sanghuangporus vaninii;Fruiting body;Active components;Content comparison;Growth stage

桑黄是一类具有珍贵价值的大型药用真菌，享有“森林软黄金”之美誉，在我国已有2 000多年的使用历史，在《神农本草经》《本草纲目》《药性论》等医书中均有记载。伴随着近些年研究进展，桑黄的生物学分类及对应的拉丁学名在经历了历史演变后已日渐清晰。当前关于桑黄生物学活性或药用功能的研究对象主要是锈革孔菌科（Hymenochaetaceae）的桑树桑黄（Sanghuangporus sanghuang）、瓦尼桑黄［Sanghuangporus vaninii （Ljub.） L.W. Zhou & Y.C. Dai］、粗毛纤孔菌［Inonotus hispidus （Bull.） P. Karst］、火木层孔菌［Phellinus igniarius （L.） Quél］、裂蹄热带孔菌［（Tropicoporus linetus （Berk. & M.A. Curtis） L.W. Zhou & Y.C. Dai］等［1］。桑黄含有多糖类、黄酮类、香豆素、三萜类、氨基酸以及酶类等化学活性成分，现代医学研究证实桑黄有提高免疫力、抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗炎等功效，已成为国内外医药制剂与保健品行业研究与开发的热点［2-5］。

粗毛纤孔菌被认为是传统中药中桑黄的正源，国内外大量研究表明粗毛纤孔菌集抗病毒、降血糖、抗肿瘤、降血脂、抗炎抑菌等功能于一身［6-7］。瓦尼桑黄是目前生产和研究较多的桑黄品种，具有丰富的活性成分和良好的功效［8-9］。现在人工栽培的桑黄菌种主要包括瓦尼桑黄（Sanghuangporus vaninii）和粗毛纤孔菌（Inonotus hispidus）。不同的采收时期、不同的栽培模式以及产地都会对桑黄主要活动成分产生影响，是影响桑黄子实体品质的重要因素［10］。该研究对不同生长期、不同产地瓦尼桑黄和粗毛纤孔菌子实体主要活性成分进行对比，测定其粗多糖、总黄酮、总三萜、麦角甾醇的含量，以期为桑黄质量评价和桑黄生产种植提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料 供试瓦尼桑黄和粗毛纤孔菌子实体由山东省淄博市沂源县臻红桑黄农产品合作社提供。具体信息见表1。子实体经60 ℃干燥至恒重、粉碎后，过60目筛备用。

1.2 主要试剂 芦丁、熊果酸、麦角甾醇，均为标准品；无水乙醇、硫酸、苯酚、葡萄糖、硝酸铝、亚硝酸钠、冰乙酸、香草醛、高氯酸，均为分析纯。

1.3 试验方法

1.3.1 供试品提取物的制备。

1.3.1.1 粗多糖提取物制备。称取5 g桑黄子实体粉末，加入150 mL蒸馏水混合均匀，在90 ℃水浴下浸提3 h，其间经常搅拌、冷却，6 000 r/min离心15 min取上清液，沉淀部分再重复提取2次，合并上清液，将提取液旋转蒸发浓缩至原体积的10%后，加入无水乙醇，使得溶液中的乙醇浓度为80%，4 ℃下静置12 h，6 000 r/min离心15 min回收乙醇，取沉淀冷冻干燥，得粗多糖提取物。

1.3.1.2 总黄酮提取物制备。称取5 g桑黄子实体粉末加70%乙醇70 mL，50 ℃回流提取4次，每次浸提3 h，合并上清液，抽滤去除杂质，用旋转蒸发仪真空浓缩，回收乙醇，冷冻干燥，得总黄酮提取物。

1.3.1.3 总三萜提取物制备。称取5 g桑黄子实体粉末加100 mL无水乙醇，80 ℃回流提取3次，每次浸提3 h，合并上清液，抽滤去除杂质，用旋转蒸发仪在75 ℃、116 r/min，真空泵0.04～0.06 MPa条件下真空浓缩，回收乙醇，冷冻干燥，得总三萜提取物。

1.3.1.4 麦角甾醇提取物制备。精密称取0.1 g桑黄子实体粉末，置于10 mL具塞试管中，精确加入无水乙醇10 mL，密塞，摇匀，超声（工作功率200 W，频率40 kHz）提取30 min，冷却至室温，补足失重，6 000 r/min 离心3 min，移取上清液，-20 ℃低温保存备用。

1.3.2 活性成分含量的测定。

1.3.2.1 粗多糖含量测定。以葡萄糖为标准品，采用苯酚-硫酸法测定粗多糖含量［11］。将葡萄糖在105 ℃的烘箱中烘干至恒重，准确称取80 mg葡萄糖溶解，定容至500 mL容量瓶中（浓度为160 μg/mL），取7根旋盖试管，分别加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL葡萄糖溶液，用蒸馏水定容至1 mL，然后加入6%苯酚溶液（现配现用）0.5 mL后，再加入浓硫酸3.5 mL，旋紧试管盖，振荡，沸水浴15 min，迅速凉水冷却，放置5 min后在490 nm处比色测定吸光度，以吸光度为纵坐标、粗多糖浓度为横坐标绘制粗多糖标准曲线，得出线性回归方程（表2）。称取一定量的粗多糖提取物样品加蒸馏水定容，按样品糖溶液∶6%苯酚溶液∶浓硫酸=1∶0.5∶3.5（V∶V∶V）的比例加入旋盖试管，振荡，沸水浴15 min，迅速凉水冷却，放置5 min后在490 nm处比色测定吸光度，代入标准曲线回归方程，得到样品中粗多糖含量。

1.3.2.2 总黄酮含量测定。采用NaNO2-Al（NO3）比色法［12］，以芦丁为标准品绘制标准曲线。准确称取芦丁标准物（芸香叶苷，C27H30O16·3H2O）20 mg；用70%乙醇溶解，完全转移至100 mL容量瓶中，并用70%乙醇定容。分别移取上述芦丁标液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于7支25 mL容量瓶中。加5%亚硝酸钠溶液1.4 mL，摇匀，放置5 min；再加10%硝酸铝溶液1.4 mL，摇匀，静置5 min后加入4%氢氧化钠溶液10 mL，摇匀，用70%乙醇定容至刻度，10 min后在510 nm 处比色测定吸光度，以吸光度为纵坐标、总黄酮浓度为横坐标绘制总黄酮标准曲线，得出线性回归方程（表2）。称取一定量的总黄酮提取物样品加70%乙醇定容，超声5 min， 按标准曲线绘制方法取样品提取液，加入显色试剂，在510 nm 处比色测定吸光度，代入标准曲线回归方程，得到样品中总黄酮含量。

1.3.2.3 总三萜含量测定。采用冰乙酸-香草醛分光光度法，以熊果酸标准品绘制标准曲线。精密称取熊果酸标准品5.0 mg，用乙酸乙酯定容于50 mL容量瓶中，取7个旋盖试管，分别加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL熊果酸标液，水浴100 ℃加热挥去溶剂，然后分别加入新配制的4%香草醛-冰乙酸溶液0.4 mL和高氯酸1.0 mL，在65 ℃水浴15 min后，冷却至室温，并加入5 mL冰乙酸，摇匀后放置15 min，在548 nm 处比色测定吸光度，以吸光度为纵坐标、总三萜浓度为横坐标绘制总三萜标准曲线，得出线性回归方程（表2）。称取一定量的总三萜提取物样品加乙酸乙酯溶解，超声提取2 h（工作功率200 W，频率40 kHz）后定容，过0.22 μm有机相滤膜，得到的滤液待测。按标准曲线绘制方法加入显色试剂，在548 nm处比色测定吸光度，代入标准曲线回归方程，得到样品中总三萜含量。

1.3.2.4 麦角甾醇含量测定。参照李南臻等［13］的方法测定，略有改动。迅速精确称取麦角甾醇标准品0.005 g，快速溶解于无水乙醇，定容至50 mL，即得到100 μg/mL麦角甾醇标准品母液。精密吸取母液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL用无水乙醇稀释定容至10 mL，配制成5、10、20、30、40、50 μg/mL麦角甾醇标准系列溶液，-20 ℃避光保存备用。分别精密吸取配制好的各浓度麦角甾醇标准系列溶液于比色皿中，在波长292 nm下分别测定各标准溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标、麦角甾醇浓度为横坐标绘制麦角甾醇标准曲线，得出线性回归方程（表2）。将样品提取液稀释5倍，过0.22 μm微孔有机相滤膜得到滤液待测。按标准曲线绘制方法在292 nm 处比色测定吸光度，代入标准曲线回归方程，得到样品中麦角甾醇含量。

2 结果与分析

2.1 不同采收期粗毛纤孔菌子实体活性成分含量比较 从不同采收期粗毛纤孔菌子实体粗多糖、总黄酮、总三萜、麦角甾醇含量（图1）可以看出，不同采收期（30、60、180 d）粗毛纤孔菌粗多糖、总黄酮和总三萜含量均存在明显差异。粗多糖含量随子实体生长不断增加，30 d采收粗多糖含量为2.83%，60 d采收粗多糖含量为3.48%，在180 d采收时粗多糖含量最高，达到4.52%。

不同采收期粗毛纤孔菌子实体总黄酮含量和麦角甾醇含量均呈现先增加后降低的变化趋势。黄酮类化合物由苯丙氨酸代谢途径合成而来，具有多种生理活性功能。30、60、180 d采收时，粗毛纤孔菌子实体总黄酮含量分别为1.46、5.23、1.68 mg/kg，60 d采收时总黄酮含量最高，这个变化趋势与张文隽等［14］报道的桑树桑黄不同采收期的总黄酮含量变化一致，均是在60 d时总黄酮含量最高。麦角甾醇是真菌细胞膜的重要组分，是真菌类物质的标志性化合物，具有抗肿瘤、抗炎、降低胆固醇、治疗偏头痛等作用［15］。该试验结果显示，在30 d采收时粗毛纤孔菌子实体麦角甾醇含量仅为3.86 mg/kg，在60 d采收时麦角甾醇含量达到最高，为34.03 mg/kg，180 d采收时麦角甾醇含量为19.60 mg/kg。目前麦角甾醇常作为测定生物量的指标，因为在细胞死亡后，存在于细胞膜上的麦角甾醇会很快发生降解。从这个角度上看，粗毛纤孔菌在30 d采收时活性较低，处于初生阶段，60 d 采收时活性旺盛，180 d采收时活性又下降。

不同采收期粗毛纤孔菌子实体总三萜含量呈现先减少后增加的变化趋势。总三萜也是桑黄的主要功效成分，具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化、保肝护肝、降血糖、提高免疫力和防治心脑血管系统疾病等功效。该试验结果显示，粗毛纤孔菌子实体在30 d采收时总三萜含量为0.61 mg/kg，在60 d 采收时总三萜含量降低为0.06 mg/kg，在180 d采收时总三萜含量为0.57 mg/kg，这与王伟科等［16］报道的瓦尼桑黄不同采收期总三萜含量变化一致，说明采收期对供试菌株子实体总三萜含量产生了显著的影响。

2.2 不同产地、不同采收期瓦尼桑黄子实体活性成分含量比较 从表3可以看出，分别采自合作社山东基地（S1）和黑龙江基地（S2）的1年生椴木栽培瓦尼桑黄子实体总三萜和麦角甾醇含量差异不显著，但山东基地1年生椴木栽培瓦尼桑黄子实体粗多糖、总黄酮含量明显高于黑龙江基地1年生椴木栽培瓦尼桑黄子实体。不同生长时期瓦尼桑黄子实体活性物质存在显著差异，3年生椴木栽培（S3）瓦尼桑黄子实体总三萜和麦角甾醇含量分别为0.17和5.86 mg/kg，显著高于1年生（S1）子实体总三萜和麦角甾醇含量（0.06和1.90 mg/kg），但同一产地3年生椴木栽培（S3）瓦尼桑黄子实体粗多糖和总黄酮含量显著低于1年生椴木栽培（S1）瓦尼桑黄子实体。

2.3 不同菌种桑黄子实体活性成分含量比较 从表3可以看出，瓦尼桑黄（S1～S3）和粗毛纤孔菌（S4～S6）2个试验菌株子实体在活性成分含量上存在明显差异。180 d采收的粗毛纤孔菌（S6）子实体粗多糖含量最高，为4.52%，1年生椴木栽培（S1）瓦尼桑黄子实体总黄酮含量最高，为10.06 mg/kg，30 d采收的粗毛纤孔菌（S4）子实体总三萜含量最高，为0.61 mg/kg，60 d采收的粗毛纤孔菌（S5）子实体麦角甾醇含量最高，为34.03 mg/kg。总体来看，粗毛纤孔菌子实体活性成分含量优于瓦尼桑黄子实体。

3 讨论

桑黄作为重要的药用真菌资源日益受到关注，桑黄产业不断发展。自2009年至今，已有湖北、安徽、吉林、甘肃、浙江等省份陆续颁布了桑黄的相关地方标准以及种植的桑黄中药饮片炮制规范，这对于桑黄产业发展起到了重要的促进作用。该试验采用瓦尼桑黄和粗毛纤孔菌2个不同菌种子实体进行了不同采收期及产地的活性成分含量测定，结果显示，不同菌种不同采收期及产地的桑黄子实体活性成分含量存在明显差异，这可能与供试菌种的特性有关，桑黄在生长过程中受诸多因素影响，包括产地温湿度、光照等环境因子、培养料营养情况、采收期长短，因此最终的试验结果不能一概而论。伴随着桑黄栽培技术的发展和成熟，筛选优良菌株始终是产业发展重要的基础和保障。

粗毛纤孔菌子实体在颜色、质地等外观及内在组织结构方面与瓦尼桑黄子实体有明显不同，因此推测粗毛纤孔菌子实体生长发育进程也与其他桑黄有明显差异。试验结果显示，粗毛纤孔菌子实体中有些活性成分优于瓦尼桑黄，180 d采收的粗毛纤孔菌子实体粗多糖含量最高，为4.52%，30 d采收的粗毛纤孔菌子实体总三萜含量最高，为0.61 mg/kg，尤其是60 d采收的粗毛纤孔菌子实体麦角甾醇含量达到34.03 mg/kg，显示出较高的生物活性。因此，在实际应用中应选择目标功效成分含量高的菌株；同时根据试验结果也要注意到不同采收期对子实体活性成分的影响，过早或过迟均会影响活性成分含量，因此生产上要根据情况确定最佳采收期。今后应更加关注桑黄生理生化、活性标志物及其结构和作用机理、桑黄生物活性物质代谢机理及调控机制等基础研究，才能更好地发挥桑黄这一宝贵资源价值、为人民生命健康服务。

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