3种石斛种子无菌播种快繁技术

摘要 为了解鼓槌石斛、细茎石斛和球花石斛种子无菌播种快繁技术，以3种石斛种子为研究对象，探讨不同培养基、激素种类以及浓度配比对3种石斛种子无菌萌发、原球茎增殖和种苗壮苗生根的影响。结果表明：3种石斛种子的萌发率最高均在1/2MS基础培养基和添加10%马铃薯的1/2MS培养基上；鼓槌石斛和球花石斛原球茎增殖培养基以1/2MS+10%马铃薯+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA最佳，细茎石斛原球茎增殖培养基以1/2MS+10%马铃薯+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA最佳；鼓槌石斛生根壮苗培养基以1/2MS+0.10 mg/L IBA+10%马铃薯+2.0%蔗糖+0.6%琼脂最佳，球花石斛和细茎石斛的生根壮苗培养基以1/2MS+0.50 mg/L IBA+10%马铃薯+2.0%蔗糖+0.6%琼脂最佳。

关键词 石斛属；无菌萌发；原球茎增殖；壮苗生根

中图分类号 S 567.23 文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2024）20-0155-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.20.038

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Rapid Propagation Technique of 3 Kinds of Dendrobium Seeds

LINGHU Ke-nian，YANG Yan-bing，YAN Feng-xia et al

（Key Laboratory of National Forestry and Grassland Administration on Biodiversity Conservation in Karst Mountainous Areas of Southwestern China，Guizhou Academy of Forestry，Guiyang，Guizhou 550005）

Abstract To understand the Dendrbium chrysotoxum，Dendrobium moniliforme and Dendrobium thyrsiflorum seed sterile plant rapid propagation techniques，in this paper，three kinds of Dendrobium seeds as the research object，discusses different types of medium，hormone and concentration ratio of 3 kinds of Dendrobium sterile seed germination，protocorm proliferation and seedling seedling rooting effect.The results showed that the highest germination rate of the 3 Dendrobium seeds was on 1/2MS base culture and 1/2MS medium with 10% potato.Dendrobium chrysotoxum and Dendrobium thyrsiflorum were optimized with 1/2MS +10% potato +0.50 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，while Dendrobium moniliforme was optimized with 1/2MS +10% potato +1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA.The best rooting and seedling medium of Dendrobium chrysotoxum moniliforme was 1/2MS+0.10 mg/L IBA+10% potato +2.0% sucrose +0.6% AGAR，and the best rooting and seedling medium of Dendrobium thyrsiflorum and Dendrobium moniliforme was 1/2MS+0.50 mg/L IBA+10% potato +2.0% sucrose +0.6% AGAR.

Key words Dendrobium spp.;Sterile germination;Protocorm proliferation;Strong seedling rooting

石斛（Dendrobium spp.）是兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium Sw.）植物的总称，全世界约有1 500个原始种，13 600余个杂交种［1-2］。早期记载我国共有72种和2个变种［3］，但随着新种和新纪录的发现，我国石斛属植物已上升至81种，分布在西南、华南等热带、亚热带地区以及秦岭以南各省［4］。石斛茎含有生物碱、多糖、黄酮等多种药用成分［5］，具有良好的抗肿瘤、抗衰老、抗氧化、降血糖以及提高免疫力等药用功效［6-8］，是著名的传统中药材。同时，由于石斛种类繁多、花形多样、花色丰富、花期长，亦极具观赏价值，民间常称“石斛兰”，是世界“四大洋兰”之一［9-11］。

作为附生的兰科植物，对环境要求严［12-13］，高度特化与艳丽的花特征，致使其传粉受精需要特定形态昆虫，自然状态下授粉困难，结实率低；此外，其种子无胚乳，需特定的共生菌为其提供营养才能正常萌发，自然更新困难［14-16］。加之人为过度采挖，受威胁严重，野生资源极度稀少，在《中国生物多样性红色名录——高等植物卷（2020）》中已有42种石斛被评估为极危（CR）或濒危（EN）物种，且2021年9月发布的《国家重点保护植物名录》中，石斛所有种均列为国家重点保护植物。因此，开展石斛扩繁技术研究对石斛资源保护意义重大。

目前，石斛主要依靠分株繁殖，繁育能力低下且生长缓慢，存在繁殖系数低、周期长等缺陷［16］。近年来，随着组培快繁技术快速发展，翅萼石斛、铁皮石斛等均突破了快速扩繁技术瓶颈，并取得了显著成效［17-18］，为石斛资源的保育与可持续利用提供了重要基础。鉴于此，笔者以鼓槌石斛、细茎石斛和球花石斛3种石斛种子为材料，探讨不同的基础培养基、天然有机添加物、激素种类和激素浓度配比对石斛种子萌发率、原球茎增殖以及生根壮苗等的影响，旨在通过快繁技术建立3种石斛的规模化技术体系，为石斛资源的保育与可持续利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料来自贵州省林业科学研究院贵州·石斛种质资源库，是经人工授粉后的鼓槌石斛（Dendrobium chrysotoxum）、细茎石斛（Dendrobium moniliforme）和球花石斛（Dendrobium thyrsiflorum）的蒴果。其中，鼓槌石斛5月中旬开花，7 d后进行人工授粉，11月初果实成熟，孕育期170 d；细茎石斛6—11月陆续开花，11月初开花，10 d左右进行人工授粉，次年6月中旬果实成熟，孕育期210 d；球花石斛6月初开花，7 d左右人工授粉，12月初果实成熟，孕育期160 d。

_{zrqFmMhW+g+SmH8UDWnwgw==}1.2 方法

1.2.1 培养条件。

试验采用MS、1/2MS、B5、1/2B5作为基础培养基，筛选最优基础培养基后附加一定量的植物生长调节剂（6-BA、NAA、IAA、IBA）和10%天然有机附加物（马铃薯、香蕉、玉米、大豆），所有培养基均以加入0.5 g/L活性炭、葡萄糖20 g/L（生根为10 g/L）及6 g/L琼脂作为固定剂，加热完全融化后调pH在5.2～5.4，分装入培养瓶中，每瓶40 mL，用瓶盖封口，每处理接种20瓶，放置于蒸气高压锅内（压力1.05 kg/cm2，温度121 ℃，维持20 min）消毒，室温冷却后待用。3种石斛种子无菌萌发各阶段培养基所含天然添加物、激素配比和浓度见表1。

1.2.2 培养环境。

接种材料各生长阶段的培养在培养室完成，将接种材料置于培养室中每层具2支40 W的日光灯的培养架上培养，培养室温度维持在（25±2）℃，光照强度30～40 μmol/（m2·s），光照时间12 h/d。

1.2.3 种子消毒。

建立无菌培养物时，外植体表面灭菌关系到试验成败，因此在石斛的组培研究中，待果实渐变为淡黄色时，剪取成熟未开裂饱满果实，先将石斛果实在自来水下冲洗3～4 h，乙醇消毒5 min，取出置于10％次氯酸钠溶液中浸泡5 min，之后用0.1％升汞溶液浸泡5 min，无菌水冲洗3～4次，无菌滤纸吸干表面水分，备用。

1.2.4 种子撒播与萌发。

在超净工作台上无菌条件下切开果皮，用接种器具将种子撒落于所配制的MS、1/2MS、B5、1/2B5固体琼脂培养基上，以筛选基础培养基对石斛种子萌发的影响；另将同一批种子分别接种于添加10%天然有机附加物马铃薯、香蕉、玉米和大豆的1/2MS基础培养上。

1.2.5 原球茎增殖与分化。

将原球茎转接于增殖分化培养基上，基础培养基选用1/2MS+10%马铃薯，并添加不同激素浓度6-BA和NAA（表1），观察3种石斛原球茎分化增殖情况。

1.2.6 壮苗生根。

当种子萌发培养基中石斛原球茎长出1 cm 及以上的芽后，将其转接至壮苗生根培养基中进行生根壮苗试验。培养基配方：以1/2MS+10%马铃薯+0.5 g/L活性炭+2.0%蔗糖+0.6%琼脂为基础培养基，并添加不同浓度IBA（0.05、0.10、0.50和1.00 mg/L）。

1.3 数据处理

采用Excel软件对试验数据进行统计处理。

萌发率=（萌发瓶数/接种瓶数）×100%

增殖率=（增殖数/接种数）×100%

生根率=（生根数/接种数）×100%

2 结果与分析

2.1 不同培养基对3种石斛种子萌发的影响

分别以MS、1/2MS、B5、1/2B5为基础培养基，将3种石斛种子（图1：A1、B1、C1）分别接种到不同萌发基础培养基D1～D4上（表2），接种后置于光照下培养28 d（图1：A2、B2、C2），可见种子由白色转为绿色，49 d叶原基长出，77 d后原球茎长成小芽（图1：A3、B3、C3），观察统计种子在各培养基中的萌发情况。结果发现（表2），3种石斛种子在1/2MS培养基上萌发数和萌发率最高，鼓槌石斛、球花石斛和细茎石斛的萌发率分别达到85%、65%和100%，以细茎石斛的萌发率最高，鼓槌石斛其次，球花石斛最低。

2.2 不同有机添加物对3种石斛种子萌发的影响

以1/2MS为基础培养基，将鼓槌石斛、球花石斛和细茎石斛种子分别接种到添加10%的马铃薯、香蕉、玉米、大豆4种培养基E1～E4上（表3）。由表3可知，种子接入以上培养基均能萌发，但萌发率各有不同。4种有机添加物中，3种石斛种子在添加10%马铃薯的培养基上萌发数和萌发率最高，萌发率高达85%及以上。其他3种有机添加物虽然萌发率均低于马铃薯，但并无褐化现象，原球茎之间不黏连，有利于转瓶继代培养。

2.3 不同激素组合对3种石斛原球茎增殖与分化的影响

以1/2MS为基础培养基，添加10%马铃薯及不同配比的激素组合（6-BA和NAA），将原球茎及带有叶芽的原球茎转接至不同激素组合及配比的培养基F1～F6上（表4、图1：A4、B4、C4）。鼓槌石斛培养基上原球茎及芽增殖速度较慢，少量植株有严重褐化现象，其余2种石斛均正常发育（图1：A5、B5、C5）。当细胞分裂素6-BA为0.2 mg/L条件下，NAA浓度为0.2 mg/L时，3种石斛植物的分化增殖率最高，之后随着NAA浓度的增加，3种石斛植株的分化均呈下降趋势，说明生长素NAA的浓度以0.2 mg/L为宜，NAA浓度≥0.5 mg/L有抑制植株分化的趋势。

在生长素NAA为0.2 mg/L条件下（F1～F3），随着细胞分裂素6-BA浓度的增加，鼓槌石斛和球花石斛原球茎的增殖数和增殖率呈下降趋势，说明0.5 mg/L 6-BA适宜诱导鼓槌石斛和球花石斛增殖；对细茎石斛来说，随着6-BA浓度的增加，原球茎的增殖数和增殖率呈先上升后下降的趋势，6-BA浓度为1.0 mg/L时，细茎石斛增殖数和增殖率最高，表明1.0 mg/L 6-BA浓度能明显促进细茎石斛增殖。因此，鼓槌石斛和球花石斛原球茎增殖较适宜的培养基为1/2MS+10%马铃薯+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；细茎石斛原球茎增殖适宜的培养基为1/2MS+10%马铃薯+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。

2.4 不同激素组合配比对3种石斛壮苗生根的影响

以1/2MS为基础培养基，添加10%马铃薯及不同浓度IBA，将较大的无根苗转入生根培养基G1～G4上培养（表5）。观察G1～G4培养基发现，培养28 d左右，植株生长旺盛，3种石斛均长出2～3条1～3 cm长的根（图1：A6、B6、C6）。随着IBA浓度的增加，3种石斛种苗的生根数和生根率均呈先上升然后下降趋势。当IBA为0.10 mg/L时，鼓槌石斛生根率达95.0%，高于0.10 mg/L时，该种的生根率降低，表明低浓度的IBA有利于鼓槌石斛根的产生，高浓度IBA对根的诱导及萌发有抑制作用。当IBA浓度为0.50 mg/L时，球花石斛和细茎石斛生根数和生根率达到最高，分别为87.5%和100%，且根呈绿色，根与根之间有相互缠绕，植株生长旺盛，无褐化现象，因此鼓槌石斛的生根培养基以1/2MS+0.10 mg/L IBA+10%马铃薯+2.0%蔗糖+0.6%琼脂为宜；球花石斛和细茎石斛的生根培养基以1/2MS+0.50 mg/L IBA+10%马铃薯+2.0%蔗糖+0.6%琼脂为宜。

3 讨论

3.1 基础培养基对3种石斛种子萌发和原球茎诱导的影响

自然条件下的石斛种子存在萌发困难、萌发率低等问题，随着无菌播种快繁技术的应用，越来越多的石斛属植物播种技术趋于成熟。适宜的基础培养基为种子萌发提供所需要的养分和水分，是提高种子萌发率的基础。在该试验中，用MS、1/2MS、B5和1/2B5培养基诱导鼓槌石斛、球花石斛和细茎石斛种子萌发，结果表明，4种培养基均能促使石斛种子萌发，但在1/2MS培养基上3种石斛种子的萌发数和萌发率最高。这可能是由于不同培养基所含元素和浓度不同，进而影响种子的萌发率；同时，与张梅等［19-20］研究结果相似，低浓度无机盐培养基更能促进种子萌发。

种子萌发还受天然有机添加物的影响，适宜的天然有机添加物能为种子萌发提供矿质元素和养分。该研究结果表明，接种于分别添加10%马铃薯、10%香蕉、10%玉米和10%大豆的4种培养基上的3种石斛种子均能萌发，其中以添加10%马铃薯培养基上的萌发数和萌发率最高，高达85%及以上。这表明种子萌发期间需要营养支持，而相较于其他天然有机添加物，10%马铃薯对石斛种子萌发的促进效果最好，这可能与马铃薯富含维生素（B1和B2）和矿质元素（钾、铁、镁以及碳水化合物和氨基酸）有关［21-22］。此外，Miransari等［23］研究认为，种子在萌发过程中需要大量的氮，因而在培养基中添加马铃薯会提高种子的发芽率。

3.2 不同激素配比对3种石斛原球茎分化增殖的影响

石斛属植物扩繁的关键时期是原球茎增殖和丛生芽诱导阶段，试验中常采用激素处理并添加一定量的细胞分裂素来提高增殖诱导效果［18］。石斛原球茎对激素的需求较为敏感，分化程度也越高，张梅等［19，24］研究认为，0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA培养基中原球茎的分化效果最佳，与该研究结果相同。当细胞分裂素6-BA为0.2 mg/L条件下，NAA浓度为0.2 mg/L时，3种石斛植物的分化率最高，之后随着NAA浓度的增加，3种石斛植株的分化均呈下降趋势；生长素NAA为0.2 mg/L条件下，细胞分裂素6-BA浓度为0.5 mg/L时，鼓槌石斛和球花石斛原球茎增殖率最高；6-BA浓度为1.0 mg/L时，细茎石斛增殖分化率最高。这表明在培养基含有低浓度的细胞分裂素时，只有低浓度的NAA能有效促进石斛原球茎的增殖率，高浓度NAA反而对原球茎的增殖起抑制作用。在低浓度NAA（0.2 mg/L）培养基中，低浓度的6-BA（0.2 mg/L）能有效促进鼓槌石斛和球花石斛原球茎的增殖，中等浓度NAA（1.0 mg/L）则促进细茎石斛原球茎增殖，高浓度NAA均抑制石斛原球茎增殖，说明3种石斛原球茎的诱导在低、中浓度的生长素NAA和细胞分裂素6-BA中最佳，因此鼓槌石斛和球花石斛分化较适宜的培养基为1/2MS+10%马铃薯+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；细茎石斛适宜的培养基为1/2MS+10%马铃薯+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。

3.3 不同外源激素对3种石斛种苗壮苗生根的影响

壮苗生根阶段是植物组织培养的重要阶段之一，常在培养基中使用一定量的激素诱导石斛种苗壮苗生根［25］。如张书萍等［26-27］研究认为，添加一定量的激素IBA能有效促进石斛苗生根。该研究发现，3种石斛种子的生根数和生根率随IBA浓度增加均呈先上升后下降的趋势，当IBA为0.10 mg/L时诱导的鼓槌石斛生根率最高，为95.0%，当IBA浓度为0.50 mg/L时诱导的球花石斛和细茎石斛生根数和生根率最高，分别为87.5%和100%，且根生长旺盛，无褐化现象。这说明IBA对石斛种苗生根壮苗的诱导效率与激素浓度有关，且不同种类石斛种苗所需激素浓度不同。罗玉婷等［28］研究发现，IBA浓度超过种苗适宜范围，会导致苗矮化，长势呈下降状态，降低组培苗的质量。因此，通过研究得出鼓槌石斛的生根培养基以1/2MS+0.10 mg/L IBA+10%马铃薯+2.0%蔗糖+0.6%琼脂为宜；球花石斛和细茎石斛的生根培养基以1/2MS+0.50 mg/L IBA+10%马铃薯+2.0%蔗糖+0.6%琼脂为宜。

4 结论

通过大量的培养基筛选试验，发现1/2MS培养基比MS、B5和1/2B5培养基更有利于3种石斛种子萌发；在1/2MS培养基中添加10%马铃薯比添加10%香蕉、10%玉米或10%大豆更能提高3种石斛种子的萌发率。3种石斛原球茎的诱导在低、中浓度生长素NAA和细胞分裂素6-BA中最佳，表现出鼓槌石斛和球花石斛原球茎增殖培养基为1/2MS+10%马铃薯+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；细茎石斛原球茎适宜培养基为1/2MS+10%马铃薯+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。不同浓度对3种石斛生根壮苗效率不同，表现为鼓槌石斛的生根培养基以1/2MS+0.10 mg/L IBA+10%马铃薯+2.0%蔗糖+0.6%琼脂最佳；球花石斛和细茎石斛的生根培养基以1/2MS+0.50 mg/L IBA+10%马铃薯+2.0%蔗糖+0.6%琼脂最佳。

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