有机肥对烟叶次生代谢物影响分析

摘要 肥料是影响烟叶产量、品质的重要因素之一，其中施用有机肥可促进烟叶增产，改善烟叶品质。为探究增施有机肥对烟叶代谢的影响，以云烟87为材料，通过增施0、900和1 500 kg/hm2 3个不同梯度的炭基（酒糟）有机肥处理后，利用液相色谱质谱方法对打顶后7 d 烟叶中的代谢物进行了非靶向代谢组分析。在烟叶中鉴定了219种次生代谢物，通过代谢物比较分析发现，增施900和1 500 kg/hm2分别有14和26个代谢物相比对照组积累降低；有7种代谢物在2个处理组中均显著降低，其中包含了M780（降烟碱）、M1021（尼古丁）和M1328（可替宁）3种烟碱类代谢物。进一步分析发现，33种差异代谢物中有9种代谢物在增施900和1 500 kg/hm2 2个分组之间具有积累差异；其余差异代谢物在2个分组之间无显著积累差异。差异代谢物相关网络分析发现，山奈酚等苯丙烷途径代谢物与烟碱的积累变化紧密相关，也具有降低的趋势。结果表明，增施有机肥既能显著减少烟叶烟碱类代谢物的积累，也能在一定程度上降低烟叶苯丙烷途径代谢物的积累；增施900和1 500 kg/hm2有机肥对烟碱的影响无明显差异。综上，明确了有机肥对烟叶次生代谢物的影响，为后续烟叶生产中有机肥合理施用提供了一定的理论指导。

关键词 有机肥；烟叶；代谢物；烟碱；类黄酮

中图分类号 S 572 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2024）20-0141-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.20.035

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Analysis of the Effect of Organic Fertilizer on Secondary Metabolites in Tobacco Leaves

SHEN Shu-lin LI Hong-xun2，3， HUANG Lan4 et al

（1. College of Agronomy and Biotechnology， Southwest University， Chongqing 400715;2. Upland Flue-Cured Tobacco Quality & Ecology Key Laboratory of China Tobacco， Guiyang， Guizhou 550081;3. Guizhou Academy of Tobacco Sciences， Guiyang， Guizhou 550081;4. Bijie Branch of Guizhou Tobacco Company， Bijie， Guizhou 551700）

Abstract Fertilizer is one of the important factors a_{j6nfk/H3tzI6LN+NjO74kw==}ffecting the yield and quality of tobacco leaves， among which the application of organic fertilizer can promote the increase of tobacco leaf yield and improve the quality of tobacco leaves. To explore the effect of increasing the application of organic fertilizers on the metabolism of tobacco leaves， Yunyan 87 was used as the material in this study. After applying three different gradients of carbon-based organic fertilizers at 0， 900 and 1 500 kg/hm2， and by using the liquid chromatography-mass spectrometry method，the metabolites in tobacco leaves 7 days after topping were subjected to untargeted metabolome analysis. A total of 219 secondary metabolites were identified in tobacco leaves. Through comparative analysis of metabolites， it was found that 14 and 26 metabolites were reduced in the accumulation of 900 and 1 500 kg/hm2 respectively compared with the control group;7 metabolites in the two treatments were significantly reduced， which contained three nicotinic metabolites M780 （nornicotine）， M1021 （nicotine） and M1328 （cotinine）. Further analysis found that 9 of the 33 differential metabolites had accumulation differences between the two groups with additional application of 900 and 1 500 kg/hm2; the rest of the differential metabolites had no significant accumulation differences between the two groups. Correlation network analysis of differential metabolites found that phenylpropane pathway metabolites such as kaempferol were closely related to the accumulation changes of nicotine，and also had decreased trend. The above results showed that increasing the application of organic fertilizers could not only significantly reduce the accumulation of nicotinic metabolites in tobacco leaves， but also reduce the accumulation of metabolites in the phenylpropanoid pathway in tobacco leaves to a certain extent; there was no significant difference between adding 900 and 1 500 kg/hm2 organic fertilizer on nicotine. In summary， this study clarified the effects of organic fertilizers on secondary metabolites of tobacco leaves， and provided certain theoretical guidance for the rational application of organic fertilizers in subsequent tobacco leaf production.

Key words Organic fertilizers;Tobacco leaves;Metabolites;Nicotine;Flavonoids

有机肥是以动植物残体等富含有机质的资源为主要原料，经发酵腐熟后而成的肥料，是我国农业生产的传统肥料［1］。随着现代农业的发展，我国农业施肥体系由以传统的有机肥为主变成以高效、高生产率的化肥为主的施肥体系［2］。然而化肥的过量使用造成了土壤板结、盐碱化等问题［3］。近年来，以化肥配施有机肥的施肥体系成为趋势，大量试验研究和长期农业生产实践证明：两类肥料的混合使用可在保证土壤肥力稳定的同时兼顾土壤的保护，是保证作物稳产高产的基本措施［4-5］。因此，探究有机肥对烟叶代谢的影响，可为合理施肥提供理论依据，具有较高的研究意义与价值。在烟草种植中，有机肥具有提高烤烟产量，提升烟叶品质和改善土壤环境等多种效果［6］。同时，通过调整有机肥配方还可以降低烟草花叶病、青枯病、赤星病的发生率［7］。上述研究表明，施用有机肥对烟叶种植具有多种益处，但目前增施有机肥后烟叶生理变化机理了解较少，特别是烟叶的代谢变化尚不清楚。

烟草作为重要的经济作物，也是一种重要的模式植物，在研究植物遗传、生长发育和防御反应方面发挥重要作用［8-9］。次生代谢物是植物生长的重要物质，广泛参与植物的生命活动，其差异变化能反映植物对基因或环境改变的最终响应［10］。随着代谢组检测技术的日益成熟，近年来非靶向代谢组在烟叶研究中得到广泛应用［11］。如：向海英等［12］基于非靶向代谢组学对红花大金元不同生育期烟叶代谢图谱进行了差异分析，揭示了不同生育期烟草代谢物变化规律。李楠芬等［13］进行了不同品种雪茄烟叶晾制后代谢组的差异分析，鉴定出楚雪10号和楚雪14号2个品种烟叶晾制后的叶色差异主要与脯氨酸、水杨酸、黄酮类和生物碱的含量差异有关。因此，为明确有机肥处理对烟叶代谢物的影响，该研究以云烟87为对象，基于非靶向代谢组学，解析了增施炭基（酒糟）有机肥处理后烟叶次生代谢物的积累变化，为烟叶生产中通过合理施用有机肥提高烟叶质量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与材料

受试烟草种植于贵州省毕节市大风科技园，采取小区种植。在正常烟草管理条件下，设置0、900和1 500 kg/hm2 3个不同梯度的当地生产用炭基（酒糟）有机肥施肥处理，分别命名为CK、T1和T2。每组3次重复。于打顶后7 d，选取每组6株植株中部健康烟叶混合，将烟叶样品放入冻存管中并立即放入液氮中保存，在实验室放入-80 ℃超低温冰箱保存用于后续试验。

1.2 试验方法和条件

1.2.1 烟叶代谢物的提取。

参照Yin等［14］方法，略有改动：将冻存新鲜烟叶研磨成粉末状，称取50 mg粉末，加入1 mL 80%甲醇水溶液。使用超声仪（KQ-100E，昆山，中国）常温（25 ℃）超声提取1 h，期间涡旋3次。10 200 r/min离心15 min，吸取上清液，经0.22 μm尼龙微孔过滤样本后，转置上样瓶中，进行代谢组上机检测。

1.2.2 LC-MS/MS条件。

参照Yin等［14］方法，略有改动：液相色谱分析使用the Dionex UltiMateTM 3 000 UHPLC system（Thermo Fisher Scientific，USA）；ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard预柱（孔径：1.7 μm，2.1 mm×5.0 mm，Waters，Ireland）；Acquity UPLCBEH C18色谱柱（孔径：1.7 μm，2.1 mm×150.0 mm，Waters，Ireland）。流动相为0.1%甲酸水溶液（A）和0.1%甲酸乙腈水溶液（B）。流速为0.3 mL/min，柱温40 ℃，流动相梯度为0～2 min，5%～10% B；2～10 min，10%～25% B；10～15 min，25%～50% B；15～20 min，50%～95% B；20～23 min，95% B；23.0～23.5 min，95%～5% B；23.5～28.0 min，5% B。流速为0.3 mL/min，进样量为5 μL。

质谱分析系统为Thermo ScientificTM Q-ExactiveTM，具体参数为：正离子模式，加热电喷雾电离源（HESI），离子源电压为3.5 kV，毛细管温度为350 ℃，扫描范围为100～1 200 m/z。气流参数设置：鞘气（sheath gas）35；辅助气（auxiliary gas）10；反吹气（sweep gas）0。

1.3 数据分析

使用MS-Dail软件进行离子峰提取，对齐，得到离子峰信息，包括质核比、保留时间、二级质谱、峰面积等［15］。注释数据库由MS-Dail软件提供，具体数据库见网站http：//prime.psc.riken.jp/compms/msdial/main.html#MSP。差异代谢物统计分析使用Metaboanalyst 5.0（https：//www.metaboanalyst.ca/）网站进行［16］。使用 TBtools软件绘制差异代谢物热图［17］。相关性分析使用R语言psych包corr.test函数计算，并使用Gephi软件进行代谢网络的构建［18］。

2 结果与分析

2.1 烟叶代谢物的提取与鉴定

利用MS-Dail软件对所测样本原始离子峰进行提取，从提取的5 047个离子峰中筛选了219个高质量的注释离子峰用于后续分析（图1A、表1）。为检测代谢组数据的可靠性，对质控样本进行相关性计算，其相关系数大于0.99，符合质控要求（图1B）。对所有样本进行无监督的PCA分析（图1C），施肥量1 500 kg/hm2组（T2）与对照有着显著的区分，施肥量900 kg/hm2组（T1）与对照组无显著区分。PCA分析表明，所检测离子峰能反映施肥处理后烟草叶片的代谢差异，且随着施肥量的增加，烟叶次生代谢差异越大。

2.2 差异代谢物的鉴定

为明确受增施有机肥影响的代谢物，该研究分别将2个处理组与对照组进行差异比较分析。以差异倍数大于1.5且t-test检验P值低于0.05为标准筛选差异离子，差异离子结果见图2A、2B。900 kg/hm2施肥量（T1）处理后有14个离子积累降低；1 500 kg/hm2施肥量处理（T2）后有26个离子积累降低，1个离子积累增高（图2B）；同时有7个离子在2种处理浓度中均表现为积累降低（图2C）。这表明增施有机肥后更多的次生代谢物积累量降低。同时，在差异离子数量上也表现出与主成分分析一致的结果，施肥量1 500 kg/hm2组（T2）差异离子数多于900 kg/hm2组（T1）。上述结果表明随着有机肥施肥量的增加烟叶代谢差异越大。

进一步分析发现：在7个共有差异离子中，有3个与烟碱相关的代谢物，包括M780（降烟碱，nornicotine）、M1021（尼古丁，nicotine）和M1328（可替宁，cotinine）（表1）。同时，在19个T2组特有的差异离子中，新增2个与烟碱相关的代谢物M781（降烟碱，nornicotine）与M1023（尼古丁，nicotine）（图3）。结果表明，增施有机肥降低了烟叶烟碱的积累。此外，在T2组特有差异离子中，有M387（L-焦谷氨酸，L-Pyroglutamic acid）和M474（天冬氨酸，Aspartic acid）2种氨基酸相关代谢物；还有M1480（3-甲基-N-苯基苯胺，3-Methyl-N-phenylaniline）、M2154（N，N-二甲基十二胺，N，N-Dimethyldodecylamine）、M2592（N，N-二甲基十二胺N-氧化物，N，N-Dimethyldodecylamine N-oxide）、M3580（月桂基二乙醇胺，Lauryldiethanolamine）和M3810（硬脂酰胺，Stearamide）等胺类相关代谢物（图3）。

2.3 差异代谢物积累模式分析

研究共鉴定到33个代谢物在增施有机肥后积累降低，具体积累趋势见图3。通过t检验发现：有9个代谢物在2个处理中具有积累差异。M780（降烟碱，nornicotine）、M1021（尼古丁，nicotine）和M1328（可替宁，cotinine）3个共有的烟碱类差异代谢物与增施1 500 kg/hm2组（T2）特有的差异烟碱代谢物在2个处理组中均无显著差异。结果表明，增施900与1 500 kg/hm2有机肥对烟碱积累的影响程度无明显差异。

2.4 差异代谢物相关性分析

为进一步探究增施有机肥处理对烟叶代谢的影响。通过对差异代谢物进行相关性分析，以差异代谢物为核心筛选极显著相关（P<0.01）离子构建了代谢网络（图4）。尼古丁、降烟碱等差异代谢物处于网络中央，在网络中有山奈酚等14种苯丙烷途径代谢物与差异代谢物紧密正相关。这表明虽然在差异代谢物鉴定过程中这些代谢物没有显著的差异，但其与差异代谢物具有相似的积累趋势，即增施有机肥后这些苯丙烷途径代谢物积累量降低。

3 讨论

化肥与有机肥的混合使用是施肥体系发展的趋势。化肥能稳定、高效地提供作物生长的营养元素，而有机肥能长时间养护土壤肥力。长期的农业生产实践表明，增施有机肥可提高烟草产量，试验研究也证实，增施有机肥处理后，烟叶叶片面积与植株株高、茎围等指标显著增加［19］。因此有机肥对烟草营养生长有着促进作用。研究表明，随着有机肥施用量的增加，烟草鲜叶中次生代谢物如烟碱积累量显著降低，苯丙烷途径大量代谢物也具有积累降低的趋势。这可能是土壤肥力增加，烟叶营养生长增强，从而减少非必要次生代谢的表现。

有机肥对烟叶品质的影响主要体现在改善烤后烟叶外观、烟碱含量和香气3个方面［20］。张焕菊等［21］通过以有机肥代替部分化肥的方法对烟叶品质分析发现，中部叶、上部叶烟碱含量具有降低的趋势。这一结果与该研究增施有机肥烟碱相关代谢物积累量降低一致。该研究中，3个T1和T2共有的含量降低的烟碱类代谢物在T1和T2 组间无显著积累差异，表明随着施肥量的增加对烟叶中烟碱积累的影响逐渐变小。烟碱是烟叶的重要次生代谢物，各种香烟工艺对烟碱含量的要求不同。综合上述结果，在生产中可以尝试通过控制有机肥的施用量来调节烟叶烟碱含量，从而满足不同的香烟工艺需求。

向海英等［12］对红花大金元的研究表明，烟叶中代谢物的积累量是互相影响的。其研究发现，烟碱的积累与山奈酚含量显著正相关。在该研究中也发现，山奈酚等14种苯丙烷代谢物的积累趋势与烟碱含量具有显著的正相关，这些代谢物在不同施肥处理后具有低积累的趋势但不具有显著性。因此增施有机肥后山奈酚等苯丙烷代谢物积累降低更可能的是受到烟碱积累量的影响，即有机肥通过影响烟碱的含量间接影响了山奈酚等苯丙烷代谢物的积累。

4 结论

增施0、900和1 500 kg/hm2 3个不同梯度的炭基（酒糟）有机肥后3种烟碱类代谢物积累量显著降低，同时14种苯丙烷代谢物的积累趋势与烟碱含量紧密正相关，具有降低趋势。综上可知，可以通过合理增施有机肥来调控烟叶烟碱含量。

参考文献

［1］ 陈爱慧，田健，吴昊，等.有机肥料及其配套施肥机械的发展现状［J］.农机使用与维修，2022（9）：1-5.

［2］ 奚振邦，徐四新，杨建军.试论化学肥料和有机肥料［J］.磷肥与复肥，202 36（12）：1-5.

［3］ 杨世琦.基于国家粮食安全下的农业面源污染综合防治体系思考［J］.中国农业科学，2022，55（17）：3380-3394.

［4］ 张纪利，殷全玉，刘慧生，等.不同配方生物炭基有机肥对百色烟草生长发育和产质量的影响［J］.安徽农业科学，2022，50（19）：147-150.

［5］ 肖本青，张省委，李洪.生物有机肥在烟草生产上的应用现状及发展趋势［J］.种子科技，202 39（18）：72-73.

［6］ 韩鹤鸣.有机肥配施减量化肥对烟草产量、品质及水肥利用效率的影响［D］.凤阳：安徽科技学院，2020.

［7］ 蒋岁寒.生物有机肥综合防控烟草青枯病技术的建立与推广［D］.南京：南京农业大学，2015.

［8］ 郭兆宽，王益娜，李志远，等.本氏烟草中异源合成抗癌药物葫芦素前体［J］.热带作物学报，2023，44（1）：198-207.

［9］ 秦成.乙酰胆碱调控烟草幼苗盐胁迫的生理机制［D］.杨凌：西北农林科技大学，2020.

［10］ 王梦迪，雍旭红，印敏，等.代谢组学技术在植物次生代谢调控研究中的应用［J］.植物科学学报，2023，41（2）：269-278.

［11］ 田嘉树，丁光荣，王晓丽，等.基于文献计量学的烟草代谢组知识图谱分析［J］.烟草科技，2022，55（3）：31-38.

［12］ 向海英，刘欣，逄涛，等.基于非靶向代谢组学的红花大金元不同生育期烟叶代谢图谱差异分析［J］.中国烟草学报，2022，28（4）：77-84.

［13］ 李楠芬，于连营，杨锦鹏，等.不同品种雪茄烟叶晾制后代谢组的差异分析［J］.中国烟草科学，2022，43（2）：77-85.

［14］ YIN N W，WANG S X，JIA L D，et al.Identification and characterization of major constituents in different-colored rapeseed petals by UPLC-HESI-MS/MS［J］.Journal of agricultural and food chemistry，2019，67（40）：11053-11065.

［15］ TSUGAWA H，IKEDA K，TAKAHASHI M，et al.A lipidome atlas in MS-DIAL 4［J］.Nature biotechnology，2020，38（10）：1159-1163.

［16］ PANG Z Q，CHONG J，ZHOU G Y，et al.MetaboAnalyst 5.0：Narrowing the gap between raw spectra and functional insights［J］.Nucleic acids research，202 49（W1）：W388-W396.

［17］ CHEN C J，CHEN H，ZHANG Y，et al.TBtools：An integrative toolkit developed for interactive analyses of big biological data［J］.Molecular plant，2020，13（8）：1194-1202.

［18］ BASTIAN M，HEYMANN S，JACOMY M.Gephi：An open source software for exploring and manipulating networks［J］.Proceedings of the international AAAI conference on Web and social media，2009，3（1）：361-362.

［19］ 吕文昌.生物有机肥对植烟土壤状况和烟叶品质的影响［D］.泰安：山东农业大学，2022.

［20］ 李巧艳.烟草有机肥与生石灰配施对植烟土壤肥力和烤烟产质量的影响［D］.长沙：湖南农业大学，2016.

［21］ 张焕菊，陈刚，王树声，等.应用生物有机肥减少烤烟化肥用量试验研究［J］.中国烟草科学，2015，36（1）：48-53.