基于WGCNA鉴定阿尔茨海默病的衰老关键基因

[摘要]目的采用加权基因共表达网络分析（weightedgeneco-expressionnetworkanalysis，WGCNA）方法筛选并鉴定阿尔茨海默病（Alzheimer’sdisease，AD）相关的衰老基因。方法从GEO数据库中选择GSE132903作为分析数据集，筛选AD差异表达基因（differentialexpressedgene，DEG），采用火山图和热图进行差异基因可视化分析；从MsigDB、AgingAltas、CellAge三个数据库中下载衰老和衰老相关基因（agingandsenescence-associatedgene，ASAG）；WGCNA筛选与AD临床特征相关性最高的基因模块，并采用基因本体（geneontology，GO）、京都基因与基因组百科全书（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG）对模块内基因进行富集分析；取DEG、WGCNA关键模块基因及ASAG的交集基因得到AD衰老相关差异表达基因（ADage-relateddifferentialexpressedgene，ARDEG），使用STRING数据库进行蛋白质-蛋白质相互作用（protein-proteininteraction，PPI）网络分析寻找关键节点基因；使用GeneMANIA数据库分析ARDEG的共表达网络和相关功能；最后将筛选到的关键基因在已知AD患者数据库Alzdata中进行验证。结果共筛选出226个DEG，611个ASAG，8个ARDEG。PPI筛选出排名前5位的关键基因分别为SYP、STXBP1、VAMP2、CPLX1和STX1A。Alzdata数据库验证发现除海马区VAMP2和额叶皮层STXBP1无明显改变、额叶皮层CPLX1无表达外，5个关键基因在AD其余脑区中表达均下调，且VAMP2、STXBP1和STX1A已在AD早期出现差异表达，CPLX1与Tau病理过程有关，SYP、STXBP1与β-淀粉样蛋白和Tau病理过程均有关。结论SYP、STXBP1、VAMP2、CPLX1和STX1A均为ARDEG，有望成为AD潜在的诊断和治疗靶点。

[关键词]阿尔茨海默病；加权基因共表达网络分析；衰老基因；生物信息学

[中图分类号]R749.16[文献标识码]A[DOI]10.3969/j.issn.1673-9701.2024.28.004

ScreeningofagingkeygenesinAlzheimer’sdiseasebasedonWGCNA

LIXiaolin1，SUIXin2，MANZiteng1，CHENGTiantian1，SONGJuan1，BAOYanan1，LINYu1，YANGHongyan1

1.SchoolofPharmacyofQiqiharMedicalUniversity，Qiqihar161006，Heilongjiang，China;2.DepartmentofNeurology，theThirdAffiliatedHospitalofQiqiharMedicalUniversity，Qiqihar161000，Heilongjiang，China

[Abstract]ObjectiveUsingtheweightedgeneco-expressionnetworkanalysis（WGCNA）toexplorethekeygenesofagingassociatedwithAlzheimer’sdisease（AD）.MethodsGSE132903wasselectedfromGEOdatabaseastheanalysisdataset.Thedifferentialexpressedgenes（DEGs）ofADwerescreened，andvisualizedwithvolcanoandheatmap.Agingandsenescence-associatedgenes（ASAGs）weredownloadedfromMsigDB，AgingAltasandCellAgedatabases.WGCNAscreenedthegenemoduleswiththehighestcorrelationwithAD，andgenesofkeymodulessubsequentlyperformedwithgeneontology（GO），KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes（KEGG）enrichmentanalysis.ADage-relateddifferentialexpressedgenes（ARDEGs）wereobtainedbytakingintersectiongenesofDEGs，keymodulegenesofWGCNAandASAGs.Protein-proteininteraction（PPI）networkanalysiswasperformedusingtheSTRINGdatabasetofindkeynodegenes.Theco-expressionnetworksandassociatedfunctionsofkeygeneswereanalyzedusingtheGeneMANIAdatabase.ThekeygeneswerevalidatedinAlzdatadatabase.Results226DEGs，606ASAGsand8ARDEGswereobtained.Thetop5keygenesselectedbyPPIwereSYP，STXBP1，VAMP2，CPLX1andSTX1A.Alzdatadatabaseverifiedthattheexpressionsof5keygenesinotherbrainregionsofADweredown-regulated，exceptfornosignificantchangesofVAMP2inhippocampusandSTXBP1infrontalcortex，aswellasnoexpressionofCPLX1infrontalcortex.ThedifferentialexpressionofVAMP2，STXBP1andSTX1AappearedintheearlystageofAD，andCPLX1wasrelatedtothepathologicalprocessofTau.SYPandSTXBP1wererelatedtothepathologicalprocessesofamyloidβ-proteinandTau.ConclusionSYP，STXBP1，VAMP2，CPLX1andSTX1AareARDEGs，whichareexpectedtobepotentialdiagnosticandtherapeutictargetsforAD.

[Keywords]Alzheimer’sdisease;Weightedgeneco-expressionnetworkanalysis;Aginggene;Bioinformatics

阿尔茨海默病（Alzheimer’sdisease，AD）是一种起病隐匿且进行性发展的神经系统退行性疾病，临床上以记忆减退、失语、失认为主要特征[1-2]。AD的发病机制迄今未明，且患者的病理生理改变早于临床症状出现，现有的治疗手段只能延缓AD的进程[3]。随着社会步入老龄化时代，AD的发病率呈现逐年递增的趋势，严重影响老年人的身心健康和日常生活质量，加重患者及其家庭的经济负担，已成为严重的社会问题，深入研究AD的发病机制和治疗策略迫在眉睫。衰老是AD的关键危险因素，衰老细胞在组织中积累，通过释放炎症因子，导致与年龄相关的病理改变。临床证据表明，神经炎症在AD患者出现轻度认知障碍前即已发生，说明早期神经炎症可能由大脑中衰老细胞积累所驱动；而AD病理改变又促进衰老进程，进一步增加衰老细胞的负担和衰老大脑中的炎症。β-淀粉样蛋白（amyloidβ-protein，Aβ）的积聚和Tau病理驱动的衰老也是导致AD进程加重的原因[4]。因此，抗衰老靶向药物可预防或减轻AD的发生和发展。本研究采用加权基因共表达网络分析（weightedgeneco-expressionnetworkanalysis，WGCNA）筛选与AD相关的衰老基因，并在AD患者中进行验证，寻找AD衰老生物标志物，为AD的诊断和治疗提供新的靶点。

1资料与方法

1.1数据收集和处理

从GEO公共数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中以关键词“Alzheimer’sdisease”搜索并筛选微列阵数据集，本研究选取来源于GPL10558平台的GSE132903数据集进行分析，该数据集包含AD患者97例和非痴呆对照者98例。

1.2差异表达基因筛选

使用limmaR包对数据集进行标准化和规范化处理，输出同时满足|log2foldchange（log2FC）|>1且P<0.05的基因作为差异表达基因（differentialexpressiongene，DEG）。使用R软件ggplot2绘制火山图，ComplexHeatmap工具包绘制热图，进行可视化分析。

1.3衰老相关基因筛选

从MsigDB（https：//www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb）、AgingAltas（https//ngdc.cncb.ac.cn/aging/index）、CellAge（https：//genomics.senescence.info/cells/）3个衰老数据库中，依次以“Senescencegene”为关键词搜索、下载衰老相关基因集，对3个衰老数据库得到的基因集取并集，重复的基因只计一次，最终得到衰老和衰老相关基因（agingandsenescence-associatedgene，ASAG）合集。

1.4WGCNA

利用WGCNA方法选择适当的软阈值β构建无标度网络，采用动态剪切树法进行层次聚类；计算基因显著性（genesignificance，GS）及模块显著性（modulesignificance，MS），选取相关系数最高的模块为关键模块，模块中的基因作为候选基因。

1.5AD衰老相关差异表达基因的筛选

取DEG、ASAG及WGCNA关键模块基因的交集基因作为AD衰老相关差异表达基因（ADage-relateddifferentialexpressedgene，ARDEG），即AD和衰老共同的差异表达基因，进行后续分析。

1.6差异基因功能富集分析

利用David数据库（https：//david.ncifcrf.gov）进行基因本体（geneontology，GO）功能分析和京都基因与基因组百科全书（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG）通路富集分析。GO分析包括生物过程（biologicalprocess，BP）、细胞组分（cellularcomponent，CC）和分子功能（molecularfunction，MF）三部分，KEGG主要分析基因相关的代谢通路。

1.7蛋白质-蛋白质相互作用网络构建及关键基因筛选

通过STRING在线分析软件（http：//www.string-db.org）构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-proteininteraction，PPI）网络。利用Cytoscapes软件中的Cytohubba插件，综合多种算法筛选出评分较高的ARDEG作为关键基因。GeneMANIA数据库（http：//genemania.org/）分析ARDEG关键基因的共表达网络和相关功能。

1.8关键基因在已知AD患者数据库中的验证

为进一步验证关键基因在AD中的表达情况，借助已有的AD患者数据库（www.Alzdata.org）对筛选出的ARDEG关键基因进行验证。关键基因表达改变以log2FC形式展示，P值为调整后的P值。同时采用趋同功能基因组（convergentfunctionalgenomics，CFG）方法对关键基因进行评估，以进一步筛选在AD中发挥关键作用的核心基因。CFG评分范围0～5分，分值越高说明该基因与AD相关性越强。

2结果

2.1DEG筛选结果

共筛选出226个DEG，其中78个基因表达上调，148个基因表达下调。图1为DEG的火山图和热图。

2.2WGCNA分析结果

根据无尺度网络拟合指数和平均连接度，计算并选取相关系数为0.87，软阈值为12，构建无尺度网络。动态剪切树法进行基因聚类。通过计算分析各基因模块与临床表型之间的关系，绘制共表达模块与临床表型的相关性热图，共获得16个基因共表达模块。选择与AD表型相关性最强的黑灰色模块（cor=-0.45，P<0.01）对其进行散点图分析，GS与MS在黑灰色模块中呈正相关（r=0.39，P=5.3×10-11）。设置筛选条件为GS>0.1，MS>0.8，校正后P<0.01，进一步筛选黑灰色模块中的关键枢纽基因。剔除非编码基因后，共筛选出105个基因作为候选关键基因，见图2。

A.软阈值筛选；B.基因聚类；C.生物模块与临床表型相关性分析；D.关键生物模块特征与模块基因的相关性分析

2.3GO和KEGG富集分析结果

对DEG及WGCNA关键模块内的基因进行GO功能注释和KEGG信号通路富集分析，结果显示DEG主要富集在化学突触传递等生物学过程、神经元投射等细胞成分、可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着受体（solubleN-ethylmaleimidesensitivefactorattachmentreceptors，SNARE）绑定等分子功能及突触囊泡周期等信号通路。WGCNA关键模块基因主要参与突触囊泡内吞等生物学过程、突触囊泡膜等细胞成分、蛋白结合等分子功能及突触囊泡周期等信号通路富集，见图3。

2.4ARDEG的筛选及鉴定结果

从MsigDB、AgingAltas、CellAge三个衰老数据库中检索ASAG，取并集，共得到611个ASAG。对DEG、ASAG及WGCNA关键模块基因取交集，得到8个ARDEG，分别为SYP、VAMP2、STXBP1、CPLX1、STX1A、PTPRN、NRGN和CKMT1A，见图4。

A.DEG的GO富集分析；B.DEG的KEGG通路富集分析；

C.WGCNA关键模块基因的GO富集分析；D.WGCNA关键模块基因的KEGG通路富集分析

2.5PPI网络构建及关键基因筛选结果

通过STRING在线分析软件构建ARDEG的PPI网络，见图5A。除去一个孤立的节点（CKMT1A），采用Cytohubba插件，使用最大集团中心性、最大相邻成分、节点连接度和边缘渗滤分量等算法筛选出评分较高的前5位关键基因，分别为SYP、STXBP1、VAMP2、CPLX1和STX1A。通过GeneMANIA数据库构建关键基因共表达网络，筛选出与关键基因存在相互作用的基因20个，见图5B。

2.6关键基因验证

将筛选到的关键基因输入Alzdata数据库进行验证，除VAMP2在海马区、STXBP1在额叶皮层无明显改变和CPLX1在额叶皮层无表达外，5个关键基因在AD其余脑区中表达均下调，见图6。CFG评分由高到低分别为：STXBP1（4分）、VAMP2（3分）、CPLX1（3分）、SYP（1分）、STX1A（1分）。其中STXBP1、VAMP2、STX1A在AD早期已存在差异表达，CPLX1与Tau蛋白有关，STXBP1、SYP与Aβ和Tau形成均具有相关性，见表1。

3讨论

本研究通过WGCNA对GSE132903数据集进行分析，筛选出与AD临床特征高度相关的黑灰色模块，进一步将该模块内的基因与AD的DEG、ASAG取交集，得到8个ARDEG，构建PPI网络，最终筛选出排名前5位的关键基因：SYP、STXBP1、VAMP2、CPLX1和STX1A。

SYP（synaptophysin，突触生长蛋白）是一种钙结合糖蛋白，广泛分布于神经突触前膜的囊泡膜，释放Ca2+依赖性神经递质，参与突触小泡的进入和再循环，是突触前末梢的特异性标志蛋白[5]。SYP表达水平可反映突触的密度、分布面积和功能状态，从而反映突触的可塑性[6]。SYP被天冬酰胺内肽酶剪切后，可影响突触囊泡的再循环，导致突触功能障碍和认知障碍，促进AD发病[7]。研究发现AD模型小鼠脑组织及AD患者脑海马区域的SYP表达均下调[5，8]；临床尸检已证实AD患者前额叶和海马等脑区SYP表达下调，且其表达水平与临床症状呈负相关[9]。突触蛋白丢失是散发性AD的早期发病机制之一[10]。本研究发现SYP在AD患者各脑区表达显著下调，与上述研究结果一致，提示SYP可能通过影响突触可塑性参与AD的发生发展，可成为AD潜在的治疗靶点。

STXBP1（syntaxin-bindingprotein1，突触结合蛋白1）可与突触素1的N端结合，促进整合膜蛋白受体复合物的形成和神经递质的释放[11-12]。研究发现STXBP1缺失可导致转录和翻译的广泛失调，影响突触的发育，进而使神经元细胞在突触形成前的未成熟阶段死亡[13]。STXBP1在大鼠大脑中形成淀粉样原纤维聚集体，并在大鼠脑和细菌表达系统中表现出淀粉样蛋白特性，参与淀粉样蛋白聚集[14]。本研究发现STXBP1在AD早期已出现表达下调，且与Aβ及Tau形成密切相关，提示STXBP1可作为AD诊断和治疗的靶点。

VAMP2（vesicle-associatedmembraneprotein2，囊泡相关膜蛋白2）是SNARE复合体的重要组成部分，分布于囊泡膜上，参与神经递质释放[15]。VAMP2可作为轻度认知障碍患者向AD转变的标志物[16]。研究发现散发性AD患者早期脑脊液中VAMP2水平降低[17]。糖原合酶激酶3是一种在神经元的发育和成熟过程中非常重要的蛋白激酶。研究发现糖原合酶激酶3的激活可抑制VAMP2顺向轴突转运，导致VAMP2在胞体的聚集和轴突远端含量的降低，进一步加剧轴突转运障碍，影响突触可塑性[18]。本研究发现VAMP2在AD患者各脑区表达下调，且在AD早期就已经出现，提示VAMP2可作为AD认知功能下降的标志物，进行早期筛查。

CPLX1（complexin-1，复合素1）是突触前结构中重要的神经递质释放调节蛋白，可与钙感受器一起调控钙依赖性神经递质的快速释放，加速突触囊泡胞吐作用[19]。补益脾胃的方药可提高SAMP8小鼠海马CPLX1水平，调节突触功能，促进神经递质释放，改善小鼠学习记忆能力[20]。逍遥散可通过上调CPLX1改善大鼠的焦虑抑郁症状，说明CPLX1可能是药物发挥抗焦虑抑郁作用的关键靶点[21]。AD患者常伴焦虑、失眠、抑郁等症状；本研究发现CPLX1在AD患者脑区下调，提示可通过上调CPLX1水平缓解AD患者的失眠、抑郁等精神状况。

STX1A（syntaxin-1A，突触融合蛋白-1A）是突触蛋白家族的一种突触前质膜蛋白，与其他蛋白共同组成SNARE复合物，对调节神经递质的突触前释放至关重要[22]。STX1A位于突触前膜的囊泡里，是重要的离子通道调节蛋白，可调节神经递质的释放，影响大脑神经系统的发育[23]。研究发现STX1A基因敲除小鼠表现出异常行为，可能与破坏5-羟色胺能神经系统有关[24]。STX1A基因变异与儿童多动症易感性有关[25]。STX1A与AD相关的研究较少，本研究发现STX1A在AD早期各脑区中的表达水平下调，提示STX1A可作为AD早期检测的生物标志物。

综上，本研究通过WGCNA分析得到5个AD与衰老共同的关键基因SYP、STXBP1、VAMP2、CPLX1和STX1A，均在突触通路上富集，具有成为AD早期诊断和治疗靶点的潜力，值得进一步深入研究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

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（收稿日期：2024–06–16）

（修回日期：2024–09–08）