应用micro-CT和小动物高频超声成像系统评价实验性类风湿关节炎

摘要：目的 "建立micro-CT和小动物高频超声成像系统评价实验性类风湿关节炎研究标准。方法 "分别构建5只IL-1β拮抗剂敲除自发性关节炎小鼠和使用牛Ⅱ型胶原诱导为类风湿性关节炎（CIA）的SD大鼠。应用micro-CT对关节炎模型鼠的足趾进行成像扫描，分析骨体积分数（BV/TV）和骨表面积和组织体积的比值（BS/TV）等微观参数。使用小动物高频超声成像系统对关节炎模型鼠的膝关节进行成像，检测膝关节的回声强度，并观察膝关节是否有积液。结果 "Micro-CT可以清楚地检测到关节炎模型鼠的足趾部位膨大和畸形，微观参数BV/TV和BS/TV显著降低（Plt;0.05）。小动物高频超声成像系统可以清楚地观察到关节炎模型鼠膝关节存在积液，关节炎模型组膝关节灰度值量化反映的回声强度显著低于对照组（Plt;0.05）。结论 "应用micro-CT 和小动物高频超声成像系统分别对小动物的足趾和膝关节成像分析，可以系统地评价实验性类风湿关节炎的发展水平，弥补实验性RA成像缺乏统一标准的缺陷。

关键词：micro-CT；高频超声成像系统；类风湿性关节炎；骨体积分数；回声强度

Micro‑CT and small animal high‑frequency ultrasound were used to evaluate experimental rheumatoid arthritis

TSEDIEN Nhamdriel1， HOU Bao2， HUANG Shubing2， CAI Weiwei2， SUN Haijian2， Mi Ma1， QIU Liying2

1University of Tibetan Medicine， Lhasa 850000， China; 2Wuxi Medical College， Jiangnan University， Wuxi 214122， China

Abstract： Objective To establish the evaluation criteria of experimental rheumatoid arthritis by micro-CT and high-frequency ultrasound. Methods Five IL-1β knockout mice with spontaneous arthritis and five SD rats with rheumatoid arthritis （CIA） induced by bovine type Ⅱ collagen were constructed. Then， the toes of arthritis model mice were imaged by micro-CT， and the microscopic parameters such as BV/TV and BS/TV were analyzed. High-frequency ultrasound was used to image the knee joint of arthritis model mice to detect the echo intensity of the knee joint and observe whether there was effusion in the knee joint. Results Micro-CT could clearly detect the enlargement and deformity of the toes in the arthritis model mice， and the microscopic parameters BV/TV and BS/TV were significantly reduced. High-frequency ultrasound could clearly observe the knee joint effusion in arthritis model mice， and the echo intensity of knee joint gray value quantitative response in arthritis model group was significantly lower than that in control group. Conclusion The application of micro-CT and high-frequency ultrasound imaging analysis of small animal toes and knees can systematically evaluate the development of experimental rheumatoid arthritis， and compensate for the lack of unified standards in experimental rheumatoid arthritis imaging.

Keywords： micro-CT; high-frequency ultrasound; rheumatoid arthritis; BV/TV; echo intensity

类风湿性关节炎（RA）是一种全身性自身免疫系统性疾病［1-3］。随着RA患者发病年限的增长，RA患者的骨关节畸形的风险越高，致残率也越高［4-5］。因此较早且准确地诊断和干预治疗有利于缓解RA病程的发展和骨损伤的程度［6-7］。医学影像学方法常用于直观地诊断和监测RA疾病的进展、评估疗效及预后［8-9-］。目前显微计算机断层扫描技术（micro-CT）、MRI、静息态功能磁共振成像技术（rs-fMRI）、PET/CT和超声已被广泛应用于人体疾病检测。MRI作为非侵入性医学影像技术，是诊断骨性关节炎的主要手段［10］，但需要专业医师进行图像数据标注，对图像质量要求较高［11］；CT基于无创性高分辨率三维成像技术，可以对活体或者离体组织进行二维和三维层面的成像，并且可以直观地观察到骨损伤与骨畸形，分析骨密度流失和骨体积分数等微观数据，精确反映RA的进展程度［12-13］；高频超声成像系统因其超声频率高，图像分辨率也较高，可以实时动态无创地检测RA病变的发展进程；灰阶超声可以检测到骨关节腔积液，骨质破坏和滑膜增生［14］。

对于实验性RA的研究对象主要涉及大鼠、小鼠和兔，对成像的分辨率具有较高的要求。MRI因其使用条件和专业的图像分析医师的限制，显然不适合用于实验性RA的研究。Micro-CT因其针对性的应用于小动物和离体组织的高分辨率成像，在评估实验性RA方面存在天然的优势，可以直观地观察RA骨畸形，精确分析畸形骨的微观参数。小动物高频超声成像因其较高的超声频率，应用于小动物的实验性RA研究，可以清楚观察到骨损伤情况。虽然医学影像学的发展十分迅速，但是对于实验性RA导致的骨损伤影像评价并没有统一标准［15］。本研究旨在通过micro-CT和小动物高频超声成像技术对实验性RA导致的骨损伤成像建立研究标准， 系统的评价实验性RA的发展水平，弥补实验性RA成像缺乏统一标准的缺陷。

1 "材料与方法

1.1 "材料

小动物高频超声成像系统为Vevo[Ⓡ]3100LT系统（Fujifilm），micro‑CT为Quantum GX II成像系统（PerkinElmer），分辨率为36 、72和144 μm和的离体骨成像模式。

麻醉系统采用RAS-4 Rodent Anesthesia System，使用异氟烷麻醉剂；实验动物：10只BALB/c背景的IL-1β拮抗剂敲除自发性关节炎小鼠随机分为对照组和模型组，5只/组，8周龄体质量25±2 g。10只8周龄SD大鼠随机分为对照组和模型组，5只/组，使用牛Ⅱ型胶原诱导为CIA关节炎模型大鼠，体质量为250±20 g，大鼠和小鼠由上海斯莱克实验动物公司提供。本研究动物实验经江南大学实验动物伦理委员会批准（JN.No20230228S0250519）。

1.2 "超声系统成像参数设置

超声成像条件为：成像分辨率30 μm；频率15～70 MHz；帧频速度1000 frame/s；成像模式为B-Mode；成像探头：小鼠使用MX400、大鼠使用MX250对膝关节进行成像。

1.3 "Micro-CT系统参数设置

Micro-CT检测条件为：扫描电压选择90 kV，X射线滤光片为Cu 0.06 mm+Al 0.5 mm。电流88 μA，视野18 mm、36 mm和72 mm，分辨率36 μm、72 μm和144 μm，扫描模式为High Resolution，扫描时间4 min、角增量1.5°。对小鼠和大鼠足部进行全长和局部扫描。

1.4 "超声系统成像方法

采用Vevo[Ⓡ]3100LT小动物高频超声成像系统（Fujifilm）对小鼠和大鼠膝关节进行超声成像。成像之前将小鼠和大鼠置于麻醉盒中预麻。在对大小鼠膝关节进行超声成像的过程中，进行实时麻醉，防止实验动物苏醒。

1.5 "成像分析

对于micro-CT扫描大小鼠足部成像，由2位专业的医学影像实验师使用Analyze12.0对成像结果进行单独定性和定量分析。分析内容包括骨体积分数（BV/TV）、骨表面积和组织体积的比值（BS/TV）、骨表面积和骨体积的比值（BS/BV）。使用小动物高频超声分析软件Vevo LAB对大小鼠膝关节成像进行分析。

1.6 "统计学分析

采用Graph Prism 8.0软件进行统计分析。所有实验数据以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析和Dunnett检验。以Plt;0.05为差异有统计学意义。

2 "结果

2.1 "应用micro-CT评价自发性RA小鼠骨损伤

对照组小鼠足部骨面光滑平整，但是RA模型组小鼠足部骨面开始出现显著的畸形（图1A），对RA小鼠骨面部位的BV/TV、BS/TV和BS/BV分析结果显示，与对照组相比，模型组中BV/TV和BS/TV降低（Plt;0.01，图1B）。

2.2 "应用小动物高频超声成像检测自发性RA小鼠膝关节积液

在模型组中小动物高频超声成像显示，RA小鼠膝关节内存在显著的积液，对照组小鼠膝关节呈实质性区域且无积液（图2A）。此外，对照组小鼠膝关节灰度值反映的回声亮度值较高。而与对照组相比模型组小鼠膝关节灰度值量化反映的回声强度显著降低（Plt;0.05图2B）。

2.3 "应用Micro-CT评价RA大鼠骨损伤

在模型组中CIA大鼠骨结开始膨大，足部骨面出现畸形（图3A），而对照组骨面连续且平滑。对骨面部位的BV/TV、BS/TV和BS/BV分析发现，与对照组相比模型组中BV/TV和BS/TV也降低（Plt;0.01，图3B），与IL-1β拮抗剂敲除自发性关节炎小鼠骨关节表现类似。

2.4 "应用小动物高频超声成像检测RA大鼠膝关节积液

小动物高频超声成像显示，模型组中膝关节积液较为显著，呈低回声深色区域（图4A）；对照组中大鼠膝关节呈高亮的实质性区域。膝关节灰度值反映的回声亮度值显示，模型组膝关节灰度值低于对照组（Plt;0.01，图4B）。成像结果与RA小鼠膝关节成像结果类似。

3 "讨论

CT和超声可以清楚直观地观察到关节炎患者关节处是否有积液存在，半月板是否退变以及滑膜的增厚程度。相较其他检测手段，CT和超声有着检测速度快、无创、多维度观察和精确的诊断等优势［15］。当前应用micro-CT对实验性关节炎模型鼠分析，主要有对软骨下骨影像学的检测与分析［16］、膝关节股骨远端骨影像学的检测与分析［17-18］、足趾骨侵蚀和关节破坏影像学的检测和分析等［19-20］。本研究采用micro-CT观察了IL-1β敲除自发性关节炎小鼠足部的三维立体结构，发现模型组中小鼠足部骨面开始出现畸形，深入分析发现，关节炎小鼠的足部骨面BV/TV和BS/TV显著降低；继续用micro-CT观察牛Ⅱ型胶原诱导的大鼠CIA模型，发现与关节炎小鼠足部特征相同的结果。这表明无论是关节炎模型小鼠还是关节炎模型大鼠，micro-CT扫描结果都能直观体现大小鼠足部骨畸形水平，并且深入分析可以发现足部BV/TV和BS/TV的微观变化。因此应用micro-CT扫描RA大小鼠的足部，可以从宏观何微观同时评价实验性类风湿关节炎的严重程度。

有学者采用micro-CT研究不同时期CIA大鼠骨损伤和BV/TV的变化，发现随着RA的发展CIA发病大鼠软骨表面完整性遭破坏，BV/TV减小，骨损伤加剧［21］。该研究结果与本研究结果相同，表明本研究结果的可靠性。有研究使用能量多普勒超声可敏感地检测兔关节模型中滑膜中血流信号，并进行量化分析，用于RA滑膜炎活动性评估［22］。但是实验性RA模型通常以大小鼠为主，应用多普勒超声检测大小鼠滑膜中血流信号具有一定的难度。

随着超声分辨率的不断提高和新技术的探索应用，高频超声成像系统能更敏感、更精确地发现RA患者外周关节的积液和滑膜炎症［23-24］。目前，在临床上超声已广泛应用于RA的发展进程的诊断和治疗［25］，例如超声引导关节腔内注射、超声评价关节间间隙和膝关节滑膜超声造影等［26， 27］。本研究通过小动物高频超声成像系统检测IL-1β拮抗剂敲除自发性关节炎小鼠和CIA大鼠膝关节积液水平，并通过灰度值量化反映膝关节的回声强度，结果表明小动物高频超声成像系统对关节炎小鼠和CIA大鼠膝关节的成像清晰，可以清楚地看到积液部位。通过灰度值量化反映的回声强度得出，关节炎模型组膝关节灰度值显著低于对照组。因此，应用小动物高频超声成像系统，可以评估实验性类风湿性关节炎模型鼠的膝关节炎的发展水平。

实验性RA因为其造模方法多种多样，最终导致实验动物的骨关节病变部位不同，因此选择分析的骨病变区域也不同。对骨病变区域的分析方法也多种多样，得出的结果也相差较大，无法对实验结果进行横向对比，这阻碍了RA的研究进展。本研究借助小动物micro-CT和小动物高频超声成像系统无创和高分辨率的成像特点以及对骨微观病变分析的精确性等优点，建立实验性RA导致的骨损伤成像研究标准，系统地评价实验性RA的发展水平，弥补了实验性RA成像缺乏统一标准的缺陷，助推RA的精准研究，早日解决RA患者的病痛。

综上，应用小动物micro-CT扫描RA大小鼠的足部，可以从宏观和微观同时评价实验性类风湿关节炎的严重程度。应用小动物高频超声成像系统，可以评估实验性RA模型鼠的膝关节炎的发展水平。本研究为实验性RA的探究提供了直观、精确和科学的探索方法，为小动物micro-CT和小动物高频超声成像系统在实验性RA的研究提供参考。

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（编辑：林 "萍）