黄柏碱调节MCP-1/CCR2信号通路对特应性皮炎大鼠炎症反应的影响

[摘要]目的：探讨黄柏碱对特应性皮炎（Atopic dermatitis，AD）大鼠炎症反应的影响及其作用机制。方法：构建AD大鼠模型，大鼠分为正常组、模型组、黄柏碱低剂量组、黄柏碱高剂量组、黄柏碱+巨噬细胞趋化蛋白-1（Monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）组；给药结束后，各组大鼠做皮损评分，记录搔抓次数，HE染色观察皮肤组织病理变化，甲苯胺蓝染色测定肥大细胞数，ELISA试剂盒测定皮肤组织活性氧（Reactiveoxygenspecies，ROS）和血清免疫球蛋白（Immunoglobulins，IgE）、白介素-17（Interleukin，IL-17）、IL-6的含量，Western blot检测皮肤组织MCP-1、CC类趋化因子受体2（CC chemokinereceptor 2，CCR2）蛋白表达。结果：与正常组相比，模型组大鼠脱毛处皮肤发生溃疡、红斑，表皮和棘层增厚且有大量炎性细胞浸润，搔抓次数、肥大细胞数、ROS、IgE、IL-17、IL-6及MCP-1、CCR2蛋白表达水平增加（P＜0.05）；与模型组相比，黄柏碱低、高剂量组皮肤组织红斑、溃疡情况、炎性细胞浸润减少，未见脱屑，搔抓次数、肥大细胞数、ROS、IgE、IL-17、IL-6及MCP-1、CCR2蛋白表达水平依次降低（P＜0.05）；与黄柏碱高剂量组相比，黄柏碱+MCP-1组皮肤红斑、溃疡和炎性细胞浸润加重，搔抓次数、肥大细胞数、ROS、IgE、IL-17、IL-6及MCP-1、CCR2蛋白表达水平增加（P＜0.05）。结论：黄柏碱可能通过抑制MCP-1/CCR2信号通路降低AD大鼠炎症反应。

[关键词]特应性皮炎；炎症反应；黄柏碱；MCP-1/CCR2信号通路；巨噬细胞趋化蛋白-1

[中图分类号]R285.5 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2024）10-0013-05

Effect of Phellodendrine on Inflammatory Response in Rats with Atopic Dermatitis by Regulating MCP-1/CCR2 Signaling Pathway

YU Xianchao1， KOU Wang2， YANG Yang3

（ 1.Department of Beiyuan Outpatient， People's Liberation Army General Hospital， Jingbei Medical District， Beijing 100012， China; 2.Department of Pharmacy， the Sixth Medical Center of the General Hospital， Beijing 100037， China; 3.Department of Dermatology， the Sixth Medical Center of the General Hospital， Beijing 100037， China ）

Abstract： Objective To investigate the effect of Phellodendrine on inflammatory response in rats with atopic dermatitis （AD） and its mechanism. Methods AD rat model was established. The rats were separated into normal group， model group， low-dose Phellodendrine group， high-dose Phellodendrine group， Phellodendrine+macrophage chemoattractant protein-1 （MCP-1） group. After the end of administration， the rats in each group were scored for skin lesions， and the number of scratches was recorded， HE staining was applied to observe pathological changes in skin tissue， Toluidine blue staining was applied to determine the number of Mast cells， ELISA kits were applied to measure the content of reactive oxygen species （ROS） in skin tissue and serum immunoglobulin （IgE）， interleukin-17 （IL-17） and IL-6， and Western blot was applied to detect the expression of MCP-1 and CC Chemokine receptor 2 （CCR2） proteins in skin tissue. Results Compared with the normal group， the depilated skin of the model group developed ulcers， erythema， thickening of the epidermis and spinous layer， and a large number of inflammatory cell infiltration， the scratching times， the number of Mast cells， ROS， IgE， IL-17， IL-6， the protein expression levels of MCP-1 and CCR2 were increased （P＜0.05）. Compared with the model group， the erythema， ulcer and inflammatory cell infiltration of skin tissue in the low and high dose Phellodendrine groups were reduced， and no desquamation was found， the scratching times， the number of Mast cells， ROS， IgE， IL-17， IL-6， the protein expression levels of MCP-1 and CCR2 were decreased in turn （P＜0.05）. Compared with the high dose Phellodendrine group， the skin erythema， ulcer and inflammatory cell infiltration in the Phellodendrine+MCP-1 group were aggravated， the scratching times， the number of Mast cells， ROS， IgE， IL-17， IL-6， the protein expression levels of MCP-1 and CCR2 were increased （P＜0.05）. Conclusion Phellodendrine may reduce the inflammatory response in AD rats by inhibiting MCP-1/CCR2 signaling pathway.

Key words： atopic dermatitis; inflammatory response; phellodendrine; MCP-1/CCR2 signaling pathway; macrophage chemoattractant protein-1

特应性皮炎（AD）是一种慢性非传染性炎症性皮肤病，特点是持续的皮肤瘙痒，且长期复发，极大地降低了患者及其家人的生活质量。AD的病理生理学是复杂的、多因素的，它包括遗传疾病、表皮屏障缺陷、免疫反应改变以及皮肤微生物平衡破坏等[1]。治疗AD除了日常清洁外，局部使用皮质类固醇是其一线治疗方法，也可联合吡美莫司和他克莫司使用，中重度AD使用紫外线光疗，抗葡萄球菌抗生素是治疗继发性皮肤感染的有效药物，但对炎症的改善作用不一，且成本过高[2]。黄柏碱来源于芸香科植物黄柏的树皮和茎皮，网络药理学和实验已经证实，黄柏碱具有多靶点和多途径抑制炎症的作用，可能是一种潜在的治疗炎症相关疾病的有效药物[3]。研究发现，人巨噬细胞趋化蛋白-1（MCP-1）及其受体CC类趋化因子受体2（CCR2）在过敏性皮炎中高表达，缺乏CCR2的皮肤病小鼠的炎症因子显著降低[4]。黄柏碱能否通过调节MCP-1/CCR2信号改善AD炎症反应尚不清楚。本研究将探索黄柏碱对AD大鼠及MCP-1/CCR2信号的影响，为AD的临床治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物和材料

1.1.1 实验动物：8周龄SD雄性大鼠，购自上海泰楚生物技术有限公司[SCXK（沪）-2023-0001]，动物饲养环境为清洁安静、通风良好的SPF级动物房。

1.1.2 试剂、仪器：黄柏碱（纯度≥98%，DH0031），购自德思特生物；二硝基氯苯（DNCB，97-00-7），购自西亚试剂；活性氧（ROS）检测试剂盒（S0033S），购自碧云天生物；免疫球蛋白（IgE，ml003022）、白介素-17（IL-17，ml003003）、IL-6（ml064292）ELISA试剂盒，购自上海酶联生物；一抗MCP-1（ab7202）、CCR2（ab223366），购自美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 动物造模、分组：造模前1 d剪去大鼠背部毛发，使用脱毛膏在此区域（2 cm×2 cm）脱毛；造模当天，将2% DNCB溶液（丙酮∶橄榄油=1∶4）涂抹于背部皮肤（300μl）进行首次致敏；造模第3、5、7、9、11天，于背部脱毛处涂抹DNCB进行激发，每天1次。大鼠皮肤出现红斑、水肿、出血，表皮脱落、结痂、鳞屑等症状时，表示AD大鼠模型构建成功[5]。

大鼠随机分为正常组、模型组、黄柏碱低剂量组、黄柏碱高剂量组、黄柏碱+MCP-1组，每组12只。除正常组外，所有大鼠构建AD模型；正常组仅作脱毛处理，使用溶剂（丙酮：橄榄油=1∶4）进行涂抹，操作同造模组。确认建模成功后，将黄柏碱溶于生理盐水，黄柏碱低、高剂量组大鼠分别皮下注射2.1 mg/kg/d、10 mg/kg/d黄柏碱-生理盐水溶液[6]；黄柏碱+MCP-1组大鼠皮下注射10 mg/kg/d黄柏碱-生理盐水溶液+2μg MCP-1重组蛋白；正常组和模型组皮下注射等量生理盐水。给药持续14 d。

1.2.2 皮损评分：给药期结束后，参照SCORAD评分标准[7]，对各组大鼠皮肤脱屑/干燥、水肿/肥厚/苔藓样变、红斑/出血、抓痕/溃疡方面做分值评价：0分，无；1分，轻度；2分，中度；3分，重度；4分，极重度。

1.2.3 记录搔抓次数：使用DNCB激发大鼠后，将大鼠单独放置于安静环境，统计5 min内大鼠搔抓/舔舐身体的次数。

1.2.4 观察脱毛处皮肤病理变化：每组取6只大鼠，吸入乙醚麻醉后，腹主动脉取血5 ml，离心后取上层血清，分装储存待测；采集背部及右耳脱毛处皮肤，放入4%多聚甲醛中固定，制作石蜡切片；切片经二甲苯梯度脱蜡，乙醇梯度脱水，HE染液染色，再次脱水，二甲苯透明，封片。光镜下观察皮肤病理形态变化。

1.2.5 测定肥大细胞数量：将1.2.4石蜡切片脱蜡至水，进行甲苯胺蓝染色，光镜下肥大细胞颗粒为深蓝紫色，随机选择5个视野，计数视野下肥大细胞的数目，取平均值。

1.2.6 测定皮肤组织ROS和血清IgE、IL-17、IL-6的含量：将每组剩余6只大鼠麻醉后处死，采集背部脱毛处皮肤组织，剪碎，加入组织裂解液，匀浆后分装储存；取一份皮肤组织匀浆液，离心后取上清，使用试剂盒检测上清中ROS的含量；取1.2.4血清样本，使用ELISA试剂盒按操作要求检测IgE、IL-17、IL-6的含量

1.2.7 检测MCP-1、CCR2蛋白表达水平：取1.2.6皮肤组织匀浆液，使用Western blot法检测MCP-1、CCR2蛋白表达水平。定量匀浆液蛋白浓度，在SDS-PAGE凝胶中点样，电泳，转膜，封闭PVDF膜，剪切目的蛋白条带并置于MCP-1、CCR2抗体稀释液中过夜，常温下使用二抗孵育目的条带1 h，滴加200μl发光液，分析蛋白表达水平。

1.3 统计学分析：所有数据符合正态分布并以平均值±标准误（x¯±s）表示，使用GraphPad Prism 8.0.2分析，多组间差异采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05认为有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠皮损评分比较：正常组大鼠皮肤粉嫩，色泽均一；模型组大鼠背部发生明显红斑，抓痕较多，表皮溃疡、剥脱；黄柏碱低、高剂量组较模型组红斑、皮肤溃疡情况减少，未见脱屑；黄柏碱+MCP-1组皮损情况严重，与模型组类似。见图1。与正常组相比，模型组大鼠皮损评分升高（P＜0.05）；与模型组相比，黄柏碱低、高剂量组皮损评分呈剂量依赖性降低（P＜0.05）；与黄柏碱高剂量组相比，黄柏碱+MCP-1组皮损评分升高（P＜0.05）。见表1。

2.2 各组大鼠搔抓次数比较：与正常组相比，模型组大鼠搔抓次数增加（P＜0.05）；与模型组相比，黄柏碱低、高剂量组搔抓次数呈剂量依赖性减少（P＜0.05）；与黄柏碱高剂量组相比，黄柏碱+MCP-1组搔抓次数增加（P＜0.05）。见表2。

2.3 各组大鼠皮肤病理形态变化：正常组皮肤组织结构正常，无明显病理异常改变；模型组表皮和棘层增厚、过度角化，皮肤溃疡且有大量炎性细胞浸润；黄柏碱低、高剂量组较模型组表皮和棘层增厚逐渐减轻，溃疡和炎性细胞浸润逐渐减少；黄柏碱+MCP-1组表皮角化，皮肤溃疡，大量炎性细胞浸润。见图2。

2.4 各组大鼠皮肤组织肥大细胞数量比较：与正常组相比，模型组肥大细胞数量增加（P＜0.05）；与模型组相比，黄柏碱低、高剂量组肥大细胞数量呈剂量依赖性减少（P＜0.05）；与黄柏碱高剂量组相比，黄柏碱+MCP-1组肥大细胞数量增加（P＜0.05）。见图3、表3。

2.5 各组大鼠皮肤组织ROS和血清IgE、IL-17、IL-6的含量比较：与正常组相比，模型组皮肤组织ROS和血清IgE、IL-17、IL-6的含量升高（P＜0.05）；与模型组相比，黄柏碱低、高剂量组皮肤组织ROS和血清IgE、IL-17、IL-6的含量呈剂量依赖性下降（P＜0.05）；与黄柏碱高剂量组相比，黄柏碱+MCP-1组皮肤组织ROS和血清IgE、IL-17、IL-6的含量升高（P＜0.05）。见表4。

2.6 各组大鼠皮肤组织MCP-1、CCR2蛋白表达水平比较：与正常组相比，模型组MCP-1、CCR2蛋白表达水平升高（P＜0.05）；与模型组相比，黄柏碱低、高剂量组MCP-1、CCR2蛋白表达水平呈剂量依赖性降低（P＜0.05）；与黄柏碱高剂量组相比，黄柏碱+MCP-1组MCP-1、CCR2蛋白表达水平升高（P＜0.05）。

3 讨论

AD是常见的慢性炎症性皮肤病，受损的皮肤屏障可能是AD发展的第一步，这将导致进一步的皮肤炎症和过敏敏感性，免疫系统失调是AD的重要发病基础[8]。虽然关于AD确切的发病机制尚不清楚，但是学者一致认为，改善皮肤屏障功能障碍和免疫失调是治疗AD可行的方法[9]。为了进一步了解AD，本研究通过在脱毛处涂抹DNCB构建AD大鼠模型。结果显示，与正常组比较，模型组大鼠背部和耳部脱毛处皮肤溃疡、红斑、脱屑，且抓痕较多，搔抓次数增多，HE染色显示患处表皮和棘层增厚、过度角化，皮肤溃疡且有大量炎性细胞浸润，提示该模型较好地还原了AD的病理状态，模型建立成功，可以在此基础上做深一层探索。黄柏碱是一种异喹啉生物碱，以黄柏碱为主要有效成分的中药制剂已经在我国被广泛用于治疗AD[10]。黄柏碱本身具有抑制炎症的作用，本研究使用不同剂量的黄柏碱处理AD大鼠，显著缓解背部和耳部脱毛处皮肤溃疡、红斑和脱屑，病理损伤改善，抓痕和搔抓次数减少，且治疗作用随剂量升高而增强，说明黄柏碱对AD的进展具有抑制作用，研究其作用机制意义重大。

肥大细胞为一种粒细胞，积累在与过敏、伤口愈合和恶性肿瘤相关的炎症部位，通过诱导血管扩张、促进血管通透性、吸收炎症细胞促进适应性免疫反应，并调节血管的生成和纤维化，是过敏和其他炎症反应的关键引发剂和调节剂[11]。包括肥大细胞在内的几种免疫细胞以及它们产生的炎症细胞因子广泛影响与屏障功能相关的基因表达，采用全身抗炎疗法可以改善AD中功能失调的皮肤屏障[12]。IL-17主要存在于活化的CD4+ T细胞，IL-17的激活直接造成细胞间脂质的异常，这关系到AD表皮屏障的损害[13]。抑制促炎因子IL-6可显著缓解AD小鼠耳部组织肿胀及瘙痒感，改善嗜酸性粒细胞介导的过敏性炎症[14]。过高的IgE与免疫缺陷疾病有关，包括AD、复发性皮肤和肺部感染等[15]。临床研究发现，AD成年患者往往有严重的皮肤症状，并表现出高的IgE水平[16]。本研究也发现，AD大鼠血清IgE、IL-17、IL-6的含量升高，且皮肤溃疡，说明过激的免疫炎症反应可能是皮肤屏障受损的直接因素；黄柏碱处理AD大鼠显著降低IgE、IL-17、IL-6的含量，表现出了明显的抗炎作用。此外，氧化应激与AD的发展密切相关，且过敏性炎症条件和氧化应激参与特应性疾病的进展[17]。已有研究报道，肥大细胞与过敏原诱导的皮肤炎症有关，肥大细胞缺陷小鼠皮肤炎症减轻，而抑制ROS的表达可以阻止过敏原诱导的肥大细胞活化和炎症介质释放[18]。本研究亦检测到AD大鼠创伤皮肤组织ROS含量升高，这与前述肥大细胞数量增加一致；黄柏碱处理AD大鼠显著降低其ROS含量，但作用机制有待深究。

MCP-1是由单核吞噬细胞分泌的趋化因子，也是一种多克隆性炎症介质，能够吸引或增强炎症因子/细胞的表达，在炎症部位的迁移和浸润中发挥重要作用[19]。CCR2是MCP-1的受体，在慢性皮肤病中，单核细胞及其分泌蛋白MCP-1和CCR2的异常激活，单核细胞分化为巨噬细胞，并从血液转移到炎症部位，这个过程会导致病变的形成[20]。本研究中，AD大鼠病变皮肤组织MCP-1和CCR2蛋白表达水平升高，说明MCP-1/CCR2轴激活；黄柏碱可以降低AD大鼠MCP-1、CCR2蛋白表达，黄柏碱对AD大鼠症状的缓解作用可能与抑制MCP-1/CCR2信号通路激活有关；使用MCP-1与黄柏碱共同处理AD大鼠，对炎症反应及MCP-1/CCR2轴没有影响，提示黄柏碱对AD大鼠炎症反应的抑制作用与抑制MCP-1/CCR2轴激活有关。

综上，黄柏碱可能通过抑制MCP-1/CCR2信号通路降低AD大鼠炎症反应。由于AD是典型的皮肤屏障功能异常皮肤疾病，黄柏碱能否在缓解症状的同时，通过修复皮肤屏障功能降低炎症反应，也是后续研究的方向。

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[收稿日期]2023-07-20

本文引用格式：于现朝，寇旺，杨洋.黄柏碱调节MCP-1/CCR2信号通路对特应性皮炎大鼠炎症反应的影响[J].中国美容医学，2024，33（10）：13-17.