外泌体参与糖尿病肾病肾脏纤维化的蛋白组学研究进展

[摘要]糖尿病肾病（diabetickidneydisease，DKD）是糖尿病患者死亡的主要原因之一，也是终末期肾病的主要原因。DKD最典型的标记物是蛋白尿，它与肾脏疾病进展和心血管事件相关。肾血流动力学改变、氧化应激、炎症、缺氧和肾素-血管紧张素-醛固酮系统的过度激活均参与DKD的发病，其中肾纤维化起关键作用。近年来，越来越多的研究认为外泌体参与了肾纤维化的发生发展过程。本文主要介绍外泌体参与DKD肾纤维化的蛋白组学研究进展，为未来基于外泌体的纳米疗法在临床应用中的发展和转化提供参考。

[关键词]糖尿病肾病；细胞外囊泡；外泌体；纤维化；蛋白组学

[中图分类号]R587.2[文献标识码]A[DOI]10.3969/j.issn.1673-9701.2024.25.026

25%～40%的糖尿病患者可发生糖尿病肾病（diabetickidneydisease，DKD），DKD是世界范围内肾衰竭的主要原因之一[1]。尽管对DKD发生、发展过程的理解有所提高，但DKD的患病率并没有下降[2]。DKD是糖尿病的一种微血管并发症，特征为滤过膜和系膜基质扩张，导致肾脏肥厚，肾小球基底膜增厚，随后出现足细胞、肾小球及肾小管损伤，最终导致肾小球硬化和肾小管间质纤维化。DKD的发病机制和发展过程涉及多个结构、血流动力学和炎症病理生理学过程[3-4]。

外泌体是各种细胞释放到细胞外空间的纳米级（40～100nm）的膜衍生囊泡[5]，是胞外囊泡（extracellularvesicle，EV）的一种。外泌体最初被认为是细胞的废物，现在知道外泌体包含来自其原始细胞的蛋白质、脂质、代谢物、RNA和DNA等生物活性成分，并参与细胞间相互作用和多个生物过程[6-10]。这些生物囊泡存在于各种体液中，包括血浆、血清、淋巴、尿液和脑脊液等[11]。本文主要介绍不同来源的外泌体参与DKD肾纤维化在蛋白组学的研究进展。

1循环外泌体与肾纤维化

DKD患者新生血管再生不足、内皮通透性和白细胞黏附增加、一氧化氮作用降低均可导致内皮功能障碍[12]。糖尿病进展过程中，多器官出现弥漫性内皮功能障碍，提示循环中存在诱导内皮细胞损伤的潜在因素。循环内皮细胞外泌体的蛋白组学分析鉴定出1212个独立蛋白，其中有68个在高葡萄糖条件下培养的内皮细胞外泌体中被发现[13]。高葡萄糖培养条件下的内皮细胞外泌体专属蛋白与凝血、细胞信号和免疫细胞激活的信号通路相关。葡萄糖升高是内皮细胞外泌体形成的一个强有力刺激因素，它也改变了内皮细胞外泌体的分子组成，导致生物活性增加。有研究以人肾小球内皮细胞为细胞模型，采用液相色谱-串联质谱结合生物信息学、相关分析和联合通路分析，认为糖尿病患者血清外泌体主要通过上调凝血因子纤维蛋白原α亚基和下调1-甲基组氨酸引起内皮功能障碍[14]。与健康对照组相比，肾移植术后患者血浆和循环中的外泌体蛋白组学分析显示血管生成蛋白、促炎蛋白显著升高[15]，这些影响均可导致糖尿病患者肾内皮损伤和纤维化。

糖尿病微血管问题也与血管平滑肌细胞（vascularsmoothmusclecell，VSMC）损伤有关。有研究探讨VSMC外泌体在VSMC钙化中的调节和作用[16]。体外研究发现VSMC衍生的外泌体富含四肽CD9、CD63和CD81，其释放受鞘磷脂磷酸二酯酶3的调节。比较蛋白组学表明，VSMC衍生外泌体的组成与其他细胞来源的外泌体相似，同时与成骨细胞衍生的外泌体有共同成分，包括钙结合蛋白和细胞外基质蛋白。在体外，细胞外钙的升高可诱导鞘磷脂磷酸二酯酶3表达和VSMC钙化外泌体分泌，而鞘磷脂磷酸二酯酶3抑制剂可阻止VSMC钙化。重要的是，肿瘤坏死因子-α和血小板衍生生长因子等也会增加外泌体的产生，从而导致VSMC钙化增加。因此，增加外泌体释放的因素可促进血管钙化，外泌体释放途径的调节可能是一种新的预防治疗靶点。

2尿外泌体与肾纤维化

尿外泌体由肾脏细胞和尿道细胞释放。正常受试者样本中约3%的尿蛋白来自外泌体。从尿液中分离外泌体可提供超过30倍的外泌体蛋白质富集，便于通过质谱检测整个尿液中微量成分的蛋白质。通过液相色谱-串联质谱磷酸蛋白组学分析人尿外泌体的水通道蛋白-2（aquaporin-2，AQP2）的磷酸化谱，可了解肾脏集合管的通透性[17]。研究发现人类AQP2包括T269在内的所有磷酸化位点均被磷酸化，S256和S261位点的磷酸化可能在尿外泌体AQP2排泄中起主导作用。而尿外泌体中玻璃体连接蛋白也是一种潜在的独立生物标志物，可用于非侵入性监测肾移植受者的肾间质和肾小管纤维化变化[18]。使用抗氧化剂和儿茶酚-O-甲基转移酶抑制剂联合治疗可逆转糖尿病大鼠肾脏异常[19]。肾小管上皮细胞分泌并在尿外泌体中检测到的肾母细胞瘤1蛋白（Wilmstumor1protein，WT1）被认为与足细胞损伤有关。此前有研究表明外泌体中WT1水平与尿微量白蛋白与肌酐比值、血清肌酐升高及肾小球滤过率降低有关[20]。

肾脏和尿胞外囊泡（urinaryextracellularvesicle，uEV）蛋白质丰度之间的良好相关性使得尿外泌体成为研究肾脏生理学或疾病的非侵入性生物标志物来源[21]。Zubiri等[22]在人类尿外泌体中发现352种不同的蛋白质，其中AMBP、MLL3、VDAC1在DKD患者与无DKD患者中差异表达。AMBP是一种具有丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的膜糖蛋白。MLL3是一种组蛋白甲基转移酶，可甲基化组蛋白H3。VDAC1是穿过线粒体外层膜的通道蛋白，也存在于质膜中。VDAC1具有铁氰化物还原酶活性并调节细胞生长和死亡。2015年，Zubiri等[23]使用组织蛋白组学的方法对DKD大鼠肾组织的蛋白质进行差异分析，并同时进一步分析尿外泌体中是否能观察到相同的趋势。结果发现DKD肾组织中调节钙蛋白和衰老标记蛋白30显著下调，这种显著变化在尿外泌体中也有体现。Ding等[24]在DKD患者中共检测到579种尿外泌体蛋白，其中28种显示出作为生物标志物的潜在价值，通过血管生成、肾素-血管紧张素系统、流体剪切应力和动脉粥样硬化、胶原降解和免疫系统等多种途径参与DKD的发展。在另一项尿外泌体蛋白研究中共鉴定出17种参与葡萄糖有氧氧化代谢的蛋白质[25]。其中DKD患者线粒体中依赖腺苷三磷酸的6-磷酸果糖激酶、磷酸脱氢酶、乌头酸水合酶和苹果酸脱氢酶的表达降低，异柠檬酸脱氢酶亚单位表达增加并随年龄的变化而改变。在DKD早期鉴定出尿外泌体中有22种差异蛋白，其中甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2、钙调蛋白1、钙结合蛋白S100A8和S100A9可作为早期DKD的潜在生物标志物[26]。由此可知尿外泌体蛋白质在DKD的不同阶段发生变化。

3肾脏来源的外泌体与肾纤维化

肾脏是由肾小球、肾小囊和肾小管等形成的100多万个肾单位组成的，高糖可通过各种途径导致肾单位纤维化[27]。研究发现成熟肾小管上皮细胞来源的外泌体可调节体外小管样细胞功能成熟，而该作用可因高糖影响有机阴离子转运蛋白1的功能受到抑制[28]。另一研究认为，肾间质纤维化的原因是肾小管细胞来源的外泌体将信号传递给间质成纤维细胞所致。研究将来自近端肾小管细胞的外泌体加入到肾成纤维细胞培养基中，来自高糖条件的近端肾小管细胞的外泌体在成纤维细胞中诱导细胞增殖、形态变化及纤连蛋白形成、α-平滑肌肌动蛋白和Ⅰ型胶原大量产生，进一步蛋白组学分析发现，与非对照组肾小管细胞外泌体相比，高糖情况下肾小管细胞外泌体中有22种蛋白质存在差异表达，且存在蛋白质-蛋白质相互作用。基因表达分析显示烯醇酶1表达与DKD的临床表现相关[29]。

糖尿病可致肾脏出现炎症和氧化应激[30]。来自人类炎症近端肾小管上皮细胞的基底外侧EV可激活外周血单核细胞而显著增加趋化因子和免疫调节细胞因子的产生[31]。这些发现可为进一步评估EV介导的炎症途径作为生物标志物和治疗靶标提供依据。

4其他来源的外泌体与肾纤维化

外泌体是几乎所有细胞都会分泌的一种纳米囊泡，且携带信号传递相关物质。有研究发现其他细胞分泌的外泌体也可能参与肾纤维化的发生发展。最近的研究表明巨噬细胞来源的EV参与血管钙化的炎症和氧化应激[32]。该研究采用脂多糖处理的小鼠巨噬细胞作为炎症和氧化应激的细胞模型，在钙化条件下将EV添加到小鼠VSMC细胞系中，采用邻酚酞钙法评估钙化情况，结果显示脂多糖处理的巨噬细胞衍生的EV可诱导周围细胞（如VSMC）的促炎和促氧化反应，从而加剧血管钙化过程。另一项研究认为，瘦小鼠在注射从喂食高脂饮食肥胖小鼠的粪便或2型糖尿病患者的粪便中分离的外泌体后出现胰岛素抵抗。高脂饮食粪便来源的外泌体衍生的磷脂酰胆碱结合并激活抗透明质酸酶，从而使得激活胰岛素信号传导途径的相关基因的表达被抑制，被抑制的基因包括胰岛素受体底物基因及其下游基因磷脂酰肌醇-3-羟激酶和苏氨酸激酶[33]。已有研究明确脂肪细胞来源的外泌体是外周组织（如肝脏、肾脏）中连接脂肪和胰岛素抵抗的介质，外泌体可作为脂肪细胞和脂肪组织中其他细胞之间的信使[34-35]。例如，脂肪细胞来源的EV可趋化单核细胞，因此可导致的肥胖的胰岛素抵抗动物和人类的脂肪组织炎症[36-37]，而肾周脂肪组织炎症可进一步加重肾脏氧化应激和间质纤维化的发生[38]。

外泌体蛋白组学在DKD纤维化的发生、发展中发挥重要作用。不同来源的外泌体在肾脏疾病进展中发挥不同的功能，可作为DKD诊断的生物标志物。同时，外泌体也有望作为解决器官纤维化的先进疗法[39]，如骨髓间充质干细胞的外泌体、脂肪来源间充质干细胞的EV对慢性肾脏病的发生发展有治疗作用[40-41]。然而，如何隔离、净化和可扩展实现标准化的大规模生产是生物化的外泌体应用于临床所面临的挑战。肾纤维化的发生机制复杂，涉及多种细胞和途径，单靶点治疗纤维化效果并不确切。目前，许多基于外泌体的研究专注于针对单一靶点及外泌体抗纤维化的直接结果，如停止慢性组织损伤、解决局部炎症、肌成纤维细胞的失活等抗纤维化策略已在临床前研究或临床试验中进行单独或联合评估，但外泌体能否抗纤维化及其抗纤维化的效果仍需大量临床研究进一步验证。

总之，在许多基础和临床前研究中，外泌体作为靶点进行诊断或作为疗法在减轻多种类型的器官纤维化方面显示出良好的效果。利用蛋白组学的方法及多种修饰策略可进一步提高外泌体的治疗潜力，但为了更好地将外泌体疗法转化为临床应用，还需更多的研究阐明外泌体的直接抗纤维化作用。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

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（收稿日期：2024–04–08）

（修回日期：2024–08–10）