双水相手性萃取拆分马尼地平对映体

摘 要：采用含手性识别剂的乙醇/硫酸铵双水相体系对马尼地平对映体进行手性识别研究。采用单因素实验分别考察了手性识别剂的选择、识别剂的浓度、待分离组分的浓度、pH等几个方面的影响，确定了最佳分离条件：体系pH为3.0，HP-β-CD浓度为0.4mmol·L-1，马尼地平浓度为0.4mmoL·L-1，以乙腈-0.2%三乙胺溶液（25∶75）为流动相对马尼地平对映体分离效果较好，精密度和重现性好，能满足马尼地平对映体的分离。

关 键 词：双水相体系；手性识别；马尼地平

中图分类号：TQ201文献标志码： A 文章编号： 1004-0935（2024）08-1164-03

马尼地平是1，4-二氢吡啶类抗高血压药物，通过抑制细胞外Ca2+的内流，松弛血管平滑肌而起到降压作用，相比于其他类型钙拮抗剂类药物疗效显著，扩血管作用强，且副作用小。马尼地平4位C为不对称碳原子，存在两个对映体，人体中的酶和受体一般都是手性的，当手性药物进入人体后，其药理作用是通过与体内大分子之间的严格手性匹配和手性识别而实现的，研究表明马尼地平S构型的治疗作用强于R构型，因此对其对映体的拆分是获得单一对映体重要途径之一，这对于深入研究其对映体药理、生理、毒理学具有重要的意义[1-4]。

双水相萃取技术是通过在水相中加入成相物而自发形成的互不相溶的双水相。将双水相技术用于手性药物对映体的拆分，不仅保持了传质速度快、萃取时间短、操作简便、易于放大等优点，而且有机溶剂使用和残留少，甚至可完全不使用有毒试剂，符合绿色化学的发展要求，特别适合临床用途的手性药物分离，具有较好的应用前景[5-12]。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

岛津高效液相色谱仪，日本岛津公司；RE5000旋转蒸发器，河南仪源仪器有限公司；pHS-3C数显酸度计，上海雷磁有限公司；分析天平（万分之一），日本岛津公司；SB25-12DTDN超声清洗器，宁波新芝仪器有限公司。

盐酸马尼地平对映体标准样品（日本Daicel公司，批号： 2021052102） ; S-盐酸马尼地平标准品 （日本Daicel公司，批号： 20210715，纯度： 100% ） ; Ｒ-盐酸马尼地平标准品 （日本 Daicel 公司，批号： 2021715，纯度： 100% ） ；β-CD、羧甲基-β-CD、甲基-β-CD、羟丙基-β-CD（湖北常奥药业）；L-苯丙氨酸，L-甘氨酸，L-色氨酸；L-谷氨酸（深圳金福源生物科技）；硫酸铵（廊坊鹏彩精细化工）；无水乙醇、甲醇（分析纯，郑州化学试剂厂）；乙腈（色谱纯，默克公司）。

1.2 实验方法

1.2.1  双水相的配制

双水相体系配制：称取一定量的（NH4）2SO4，加水超声溶解，加入50%的乙醇，混匀放置备用。

1.2.2 双水相法分离对映体

在试管中加入一定浓度的马尼地平溶液和手性识别剂，另外再加入1.2.1配制好的双水相体系，加入pH缓冲液调节体系的pH为3.0，待溶液完全溶解，转至恒温振动器上在一定温度下振荡2h，待其溶液稳定后在刻度试管上读取上下相的体积并计算相比，分离上下相溶液，分取上下相溶液进行HPLC检测，并计算马尼地平的分配系数K和分离因子α。

1.2.3 HPLC分析

本文采用高效液相色谱法对马尼地平对映体进行检测，其色谱条件为：色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：乙腈-0.2%三乙胺溶液（25∶75）；检测波长：254 nm；流速：1mL·min-1，进样量10µL；柱温：室温。

2 结果与讨论

2.1 双水相体系的筛选及对映体分离条件的优化

影响双水相萃取的因素较多，溶质在双水相中分配的差异主要取决于溶质与双水相体系中成相组分间的各种相互作用。实验筛选合适的双水相体系，并采用单因素实验方法考察了手性识别剂的选择、识别剂的浓度、待分离组分的浓度、pH等几个方面的影响。

2.1.1 双水相体系的选择

将无水乙醇与不同的无机盐按一定比例混合，初步筛选双水相的成相物。结果只有无水乙醇/（NH4）2SO4与无水乙醇/K2HPO4·3H2O双水相体系较稳定，故以这两种体系做进一步的筛选。

双水相体系的相图是选择双水相体系的重要依据之一，相图直接反映了体系形成双水相的难易程度、稳定性、成相区域等信息，可依据相图选择体系的组成及其比例。由相图可知乙醇/（NH4）2SO4体系稳定性较好，易调节，分相迅速，上下相的黏度适中。

2.1.2 手性识别剂种类对马尼地平萃取拆分的影响

按1.2.1根据上述选取的双水相体系中分别加入不同种类的手性识别剂（β-环糊精、氨基酸类及其衍生物），以考察不同手性识别剂对马尼地平对映体萃取拆分行为的影响，结果见表1至表2。

由表1数据可知，ME-β-CD，SBE-β-CD，β-CD这三种环糊精的KS、KR的差异性很小，分离因子α均接近1，说明这三类环糊精类手性识别剂对马尼地平的识别作用很弱，这主要是和β-环糊精类手性识别剂的主客体识别机理有关，即β-环糊精疏水的空腔决定。其中HP-β-CD的分离因子α最大，这是因为HP-β-CD对许多化合物具有优良的包络作用，提高被包络物质的溶解性和稳定性。由表2可知：以这4种氨基酸作手性识别剂时，KR与KS接近，α接近1，说明氨基酸对马尼地平对映体拆分能力较弱；故不适宜选用4种氨基酸类物质作为手性识别剂。故实验最终选择HP-β-CD作为手性识别剂。

2.1.3 HP-β-CD环糊精浓度对马尼地平拆分的影响

固定马尼地平对映体浓度为0.40mmol·L-1，温度为25℃，溶液pH3.0的条件下，改变不同初始浓度HP-β-CD对马尼地平对映体K和α的影响，结果见图1。

从图1可以发现，KR与KS的变化随着HP-β-CD的浓度先增大后减小，α的变化与 HP-β-CD的识别能力成正比，当HP-β-CD的浓度为0.4mmol·L-1时，α最大，故选择HP-β-CD浓度为0.4mmol·L-1。

2.1.4 pH对马尼地平分配行为的影响

pH变化对手性药物对映体的分离影响很大，主要由于氢键作用影响药物在上相和下相的分配比。本文固定马尼地平对映体浓度为0.40mmol·L-1，固定HP-β-CD的浓度为0.4 mmol·L-1，温度为25℃，考察不同pH条件下对马尼地平对映体K和α的影响，结果见图2。

由图2可知，马尼地平的α随着pH增大先增加后减小，在pH 3.0时达到最佳分离度，α为2.31，随后α随pH增大而减小，主要是由于马尼地平显碱性，在酸性的环境下，更有利于马尼地平和手性识别剂的结合，在酸性条件下对映体在上相、下相的分配更完全，但当pH小于3时，酸性增强，一方面给双相的形成带来了困难，另一方面与手性识别剂间的氢键作用力减弱，从而影响马尼地平对映体的分离。

2.1.5 马尼地平浓度对手性萃取拆分的影响

在乙醇/硫酸铵双水相体系中，HP-β-CD为0.4 mmoL·L-1，pH=3.0条件下，分别考察不同浓度的马尼地平对拆分的影响，结果见图3。

由图3可知，马尼地平的α随着马尼地平溶液浓度的增大先增大后减小，在此过程中，因为在低浓度时，马尼地平和手性识别剂的结合较少，致使α较小，当浓度增大后达到，马尼地平对映体浓度为0.4mmoL·L-1时，其对映体有很好的分离，分离因子α高达2.29。

2.2 &nc5561d9a6d0f5eeb6c555e50a143b38cbsp;马尼地平中对映体的含量测定

本文采用乙腈、甲醇与不同浓度二乙胺、三乙胺、氨水的不同配比作为流动相系统进行了考察，结果表明，以乙腈-0.2%三乙胺溶液（25∶75）系统为流动相对马尼地平对映体分离效果较好。经过双水相萃取后，两种对映体成分得到良好的分离，分离度R都大于1.5。所以，本文选择以乙腈-0.2%三乙胺（25∶75）作为流动相，色谱峰峰形好、对称，柱效更高，精密度和重现性好，能满足马尼地平对映体的分离。

3结论

以乙醇/硫酸铵的双水相体系，分别选择不同种类的手性识别剂（如环糊精及其衍生物、天然氨基酸等），在双水相体系中分别考察其拆分效果，根据拆分效果考察识别剂浓度、pH、待测物浓度等因素对手性分离因子的影响，得到相应的手性识别分离最佳体系。双水相分离萃取可连续操作，容易放大，操作简便，且溶剂可以循环利用，为马尼地平对映体的分离纯化提供一种方便有效方法，具有工业化生产开发的前景。

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