基于柱前衍生化-GC-MS技术探究不同采摘期青钱柳叶挥发性物质组成

摘要 ［目的］采用GC-MS技术，解析青钱柳叶中的挥发性物质组成，探究13批次不同采摘期青钱柳叶中挥发性物质含量差异。［方法］用甲醇超声、甲醇加热回流、乙醇超声、乙醇加热回流、乙酸乙酯超声和正己烷超声6种提取方法，分别对青钱柳叶的挥发性成分进行提取，再结合BSTFA衍生法，综合探究青钱柳叶的挥发性成分组成；研究2023年4月15日—11月1日13个不同采摘期样品中的挥发性物质含量差异。［结果］乙酸乙酯提取-BSTFA衍生化法能更全面探究青钱柳叶中挥发性物质的组成，研究共鉴定出25种物质，青钱柳叶中挥发性物质主要是亚麻酸、棕榈酸、呋喃果糖、丙三醇、叶绿醇和硬脂酸等，脂肪酸总含量约为50%，还包括小分子有机酸、醇类和单糖类物质等。S1～S9和S10～S13批次样本物质的含量存在一定的差异。［结论］春夏季采摘的青钱柳叶不饱和脂肪酸含量较高，秋季单糖类物质含量明显增高。

关键词 青钱柳叶；挥发性物质；采摘期；柱前衍生化-GC-MS

中图分类号 R284 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2024）17-0189-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.17.044

Study on the Composition of Volatile Substances in Leaves of Cyclocarya paliurus at different Picking Stages by Pre-column Derivatization and GC-MS Technology

WANG An， CHENG Gui-lin， SU Min et al

（Chizhou Quality Supervision and Inspection Research Institute， Chizhou， Anhui 247099）

Abstract ［Objective］ GC-MS technology was used to analyse the composition of volatile substances in the leaves of Cyclocarya paliurus， and to explore the differences in the content of volatile substance in 13 batches of Cyclocarya paliurus leaves at different picking periods.［Method］ The volatile components of Cyclocarya paliurus leaves were extracted by methanol ultrasound， methanol heating reflux， ethanol ultrasound， ethanol heating reflux， ethyl acetate ultrasound and n-hexane ultrasound extraction methods， respectively， and then combined with BSTFA derivatization method to comprehensively explore the volatile composition of Cyclocarya paliurus leaves. The difference of volatile substances content in 13 batches of Cyclocarya paliurus leaves samples in different picking periods from April 15，2023 to November 1，2023 was studied. ［Result］ The ethyl acetate ultrasound extraction and BSTFA derivatization method could comprehensively explore the composition of volatile substances in the leaves of Cyclocarya paliurus. A total of 25 substances were identified in the study. The volatile substances in the leaves of Cyclocarya paliurus mainly included linolenic acid， palmitic acid， fructofuran， glycerol， phytol and stearic acid.The total content of fatty acids was about 50%， the small molecule organic acids， alcohols and monosaccharides were also included. There was a certain difference in the content of substances in the samples between S1-S9 and S10-S13 samples. ［Conclusion］Unsaturated fatty acids were higher in Cyclocarya paliurus leaves picked in spring and summer，while the monosaccharides were significantly higher in autumn.

Key words Leaves of Cyclocarya paliurus;Volatile substance;Picking stages;Pre-column derivatization and GC-MS

基金项目 安徽省药品监督管理局2022年度科技创新项目（AHYJ-KJ-202217）。

作者简介 汪安（1976—），男，安徽铜陵人，副高级药品检查员，从事药学相关研究。

收稿日期 2024-04-14

青钱柳又称青钱李、一串钱、山麻柳、摇钱树等，属于胡桃科青钱柳属，目前仅存于我国，是我国二级保护树种［1］。青钱柳多分布于安徽、江苏和湖南等地，青钱柳的树根、树皮和树叶均可入药，具有清热解毒、止痛等效果，可用于治疗顽癣［2］。现代研究表明，青钱柳叶具有清热解毒、降血脂、降血糖和降血压等作用，可用于治疗高血压和糖尿病等疾病［3-4］。

青钱柳以叶入药，有研究报道，青钱柳叶产地不同，其适宜的采收期也存在差异［5］。中药材因其生长环境不同，其代谢物在种类和含量具有差异，药材的采收期可直接影响药材的品质形成。现有文献对其黄酮类、多糖类、三萜类、酚酸类以及无机成分进行研究较多［6-8］，而对其挥发性成分研究较少。该试验采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术，用甲醇超声、甲醇加热回流、乙醇超声、乙醇加热回流、乙酸乙酯超声和正己烷超声6种提取方法分别对13批不同采摘期青钱柳叶中的挥发性成分进行提取，再结合N，O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）衍生化，综合探究青钱柳叶的挥发性成分组成，以期为青钱柳的药效物质基础和相关产品开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

安捷伦7890B-7000D气相色谱-质谱联用仪（美国安捷伦科技有限公司）；MassHunter工作站；NIST17.0质谱数据库；XPR2型电子分析天平（德国赛多利斯公司）；GeneVac miVAC DUO型真空离心浓缩仪（德祥科技有限公司）；ZWYR-2000D恒温摇床（上海智城分析仪器制造有限公司）。

1.2 耗材与材料

青钱柳叶，编号S1～S13，采摘日期分别为2023年4月15日、5月1日、5月15日、6月1日、6月15日、7月1日、7月15日、8月1日、8月15日、9月1日、9月15日、10月15日、11月1日）；乙酸乙酯、正己烷，质谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇，质谱纯，德国默克有限公司；乙醇，色谱纯，上海麦克林生化科技有限公司；无水硫酸钠，分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；BSTFA ［含1%三甲基氯硅烷（TMCS）］衍生化试剂，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；屈臣氏纯净水。

1.3 试验方法

1.3.1 挥发性成分提取液制备。

取青钱柳叶适量，用中药打粉机粉碎。称取粉末各约10 g，平行制备6组，每组加入50 mL提取溶剂，称重，其中第1组为甲醇超声（A组）、第2组乙醇超声（B组）、第3组为甲醇加热回流（C组）、第4组为乙醇加热回流（D组）、第5组为乙酸乙酯超声（E组）、第6组为正己烷超声（F组）处理，超声或加热回流1 h，放冷，称重，补足重量，取上清，于12 000 r/min离心10 min后，无水硫酸钠除水，即得提取液样本。

1.3.2

提取物衍生化溶液制备。取“1.3.1”项下制备的提取液1 mL，上清液在真空离心浓缩仪中30 ℃条件下挥干溶剂。加入20 μL甲氧胺吡啶溶液（40 mg/mL），混匀后60 ℃恒温摇床反应30 min，接着加入100 μL的BSTFA（含1% TMCS）衍生化试剂，60 ℃恒温摇床硅烷化反应60 min，最后将样本于12 000 r/min离心20 min后取上清液，即得提取物衍生化溶液。

1.3.3 气相色谱条件。采用安捷伦HP-5 MS（30 m×250 μm×0.25 μm）石英毛细管柱分析；起始温度80 ℃，维持2 min，以5 ℃/min速度升至160 ℃，维持10 min，以4 ℃/min速度升至200 ℃，维持10 min，再以10 ℃/min速度升至280 ℃，维持4 min；进样口温度240 ℃；进样体积1 μL；分流比30∶1；载气为高纯氦气；恒定流量模式，流速1 mL/min。

1.3.4 质谱条件。采用电子轰击离子源；传输线温度240 ℃；离子源温度230 ℃；四级杆温度150 ℃；离子能量70 eV；全扫描模式，扫描范围50～500 amu；碰撞气1.5 mL/min；溶剂延迟5 min。

2 结果与分析

2.1 衍生化和直接进样分析比较

取“1.3.1”项下样本直接进行GC-MS分析，考察6种提取方法直接进样分析的差异，对采集的色谱图进行色谱峰提取。甲醇超声法、乙醇超声法、甲醇加热回流法、乙醇加热回流法、乙酸乙酯超声法和正己烷超声法提取的典型色谱峰分别为19、15、18、18、16和21个。6种提取法鉴定的物质主要是十六烷酸和亚麻酸，色谱峰拖尾严重，其他物质的含量较低。6种提取法样本经过“1.3.2”项下衍生化处理后进行GC-MS分析，典型色谱峰分别为38、31、43、45、62和24个，除正己烷超声法外，其他5种提取法样本经BSTFA衍生化后提取的色谱峰均增加了1倍以上，揭示了BSTFA衍生化法能更全面探究青钱柳叶中挥发性物质的组成，其中乙酸乙酯超声法是挥发性物质鉴定的最优提取方法。不同提取法的典型GC-MS分析结果见图1。

2.2 青钱柳挥发性成分GC-MS鉴定

按“1.3.3”和“1.3.4”项下条件检测乙酸乙酯超声-BSTFA衍生化法提取的样本，使用安捷伦MassHunter软件检索NIST 17标准质谱图库，同时参考已发表的相关文献佐证，对物质进行鉴定［9］。采用面积归一化法计算各化学物质的百分含量，研究结果见表1。

由表1可知，青钱柳叶样本挥发性成分共鉴定出25种物质，占提取的62个色谱峰总面积的91.65%，表明大部分物质均被鉴定。乙酸乙酯超声-BSTFA衍生化法鉴定的主要成分有亚麻酸（31.70%）、棕榈酸（15.67%）、D-呋喃果糖（10.69%）、丙三醇（8.72%）、叶绿醇（7.49%）、甘露糖（3.30%）和硬脂酸（2.84%）等，亚麻酸、棕榈酸和硬脂酸的总含量为50.21%。还包括一些小分子有机酸（琥珀酸、苹果酸和3-羟基丙酸等）、醇类物质（1，2，3-丁三醇、L-苏丁醇）、单糖类物质（甘油单乙酸酯D-核糖、D-呋喃果糖、D-阿拉伯吡喃糖和D-核糖等）。

2.3 6种提取方法的挥发性成分对比

参照“1.3”项下的方法制备供试品（每个样本平行制备3份），同时制备质控（QC）样本，经过GC-MS检测。对采集的原始文件进行积分处理，结合前期的定性结果，获得各批次样本中主要成分的色谱峰面积。

对获得的二维数据矩阵（化合物名称和峰面积）进行一定流程处理，通过多元变量统计分析方法，探究不同采摘期物质含量差异，具体流程如下：采用MetaboAnalyst 6.0软件（https：//new.metaboanalyst.ca/）依次进行归一化（normalization by sum）、数据转化［log transformation（base 10）］和中心化（mean centering）处理，先建立PLS-DA（偏最小二乘法判别分析）模型，见图2A。从图2A可以看出，13批次样本可以明显分成2个区域，其中S10～S13聚集在一个区域，S1～S9分布在另一个区域，表明S10～S13和S1～S9批次样本存在一定的差异。

将批次S1～S9重新定义为第1组，批次S10～S13为第2组，建立OPLS-DA（正交偏最小二乘法判别分析）模型，见图2B，200次置换检验结果显示R2=0.935（P<0.01），Q2=0.858（P<0.01），表明建立的OPLS-DA模型不存在过度拟合，模型可靠。通过OPLS-DA分析得到VIP值（variable importance in the projection，变量投影重要性），再根据t检验计算得到P值判断评价质量差异的标志物。初步筛选出亚麻酸、甘露糖、2-羟基-4-甲基戊酸、D-核糖、3-亚甲基-1，4-丁二醇、D-来苏糖、D-苏糖、D-阿拉伯吡喃糖和核糖酸-1，4-内酯共9个物质为差异物质。与S1～S9批次样本（春夏季样本）相比，S10～S13批次样本（秋季样本）中亚麻酸和核糖酸-1，4-内酯的相对含量降低（P<0.05），甘露糖、2-羟基-4-甲基戊酸、D-核糖、3-亚甲基-1，4-丁二醇、D-来苏糖、D-苏糖和D-阿拉伯吡喃糖的相对含量增高（P<0.05），见图3。结合前期相对定量结果，亚麻酸是青钱柳叶中挥发性成分的主要物质，亚麻酸的含量可以有效反映其采摘期时间，4—8月采摘的青钱柳叶亚麻酸含量较9月份之后采摘的青钱柳叶高约50%。

3 总结与讨论

在研究初期，考察了甲醇超声、乙醇超声、甲醇加热回流、乙醇加热回流、乙酸乙酯超声和正己烷超声6种提取方法，发现乙酸乙酯超声法是最优的提取方法。提取物经过BSTFA衍生化后，色谱峰数量明显增加，表明BSTFA衍生化法能更全面探究青钱柳叶中挥发性物质的组成。

该研究共鉴定出25种物质，青钱柳叶中挥发性物质主要是亚麻酸，含量为31.70%。同时还含有棕榈酸、D-呋喃果糖、丙三醇、叶绿醇和硬脂酸，含量为2.84%～15.67%。脂肪酸总含量为50.21%，主要包括亚麻酸、棕榈酸和硬脂酸。

现代药理学表明，亚麻酸是一种多烯类不饱和脂肪酸，具有降血脂、降血压、抑制炎症、抗血小板聚集、防止血栓形成等功效［10］。棕榈酸是人体内的一种重要的饱和脂肪酸，具有消炎杀菌、保护心血管、抗氧化、维持肠道健康、保护皮肤等作用［11］。呋喃果糖具有抗氧化、抗炎、降血脂等作用［12］。叶绿醇是含有多支链的脂肪醇，属于链状双萜类物质，具有镇痛、抗衰老和抗氧化等作用［13］。硬脂酸具有抗氧化、维持皮肤弹性、提高免疫力和软化血管的作用［14］。青钱柳叶中所含的挥发性成分种类较为丰富，其含有的挥发性成分具有降血脂、降血压、抗炎等药理作用，该研究为青钱柳挥发性物质提供了研究基础。

有关青钱柳叶采摘期的研究，郑敏等［15］测定春季和秋季4个种源青钱柳叶中总黄酮和粗多糖含量，春季和秋季间青钱柳叶中总黄酮和粗多糖含量存在显著差异（P<0.05），不同种源之间的含量存在极显著差异（P<0.01）。林伟达［16］采用LC-MS技术，分析了青钱柳幼嫩叶片和成熟叶片之间的代谢物变化，发现幼嫩叶片适宜作为制作青钱柳茶的原材料，成熟叶片适宜作为工业生产上提取各类代谢物的原材料。吴琳琳等［17］通过HPLC技术，测定10个采收期青钱柳叶中绿原酸、异槲皮苷、槲皮素的山奈酚含量，绿原酸和异槲皮苷的含量在7月初最高，但是槲皮素和山奈酚的含量分别在8月末和9月初最高。夏和元等［18］研究不同采摘期青钱柳叶中黄酮、三萜、多糖含量与体外抗氧化和降血糖活性，确定以6、7月份采摘绿色青钱柳叶为最佳。

该研究首次采用GC-MS结合BSTFA衍生化技术，研究13个采摘期青钱柳叶中挥发性物质的含量差异。通过多元变量统计分析和t检验，批次S10～S13和S1～S9样本之间存在一定的差异，S10～S13和S1～S9批次之间筛选出核糖酸-1，4-内酯、亚麻酸和甘露糖等差异代谢物。春夏季和秋季采摘的青钱柳叶挥发性物质存在一定差异，春夏季采摘的青钱柳叶不饱和脂肪酸（亚麻酸）含量较高，秋季单糖类物质（甘露糖、D-核糖、D-来苏糖、D-苏糖和D-阿拉伯吡喃糖）含量明显增高，该研究为青钱柳叶开发相关产品提供了理论依据。

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