固相柱净化-高效液相色谱-串联质谱法测定辣椒红色素中的苏丹红

摘要 ［目的］建立一种高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）同时测定辣椒红色素中4种苏丹红染料的方法。［方法］辣椒红色素样品经正己烷提取，分子印迹柱净化，高效液相色谱柱ZORABX SB-Aq C18（3.0 mm×100 mm，3.5 μm）分离，乙腈-0.1%甲酸水梯度洗脱，ESI+电喷雾扫描，多反应监测（MRM）模式下对辣椒红色素中苏丹红进行测定，外标法定量。［结果］4种苏丹红染料在10～200 ng/mL均呈现良好的线性关系，检出限为5 μg/kg，定量限为10 μg/kg，加标量为10、20、50 μg/kg（n=6）时，平均回收率为71.0%～119.0%，相对标准偏差为1.53%～6.18%。［结论］该方法适用于辣椒红色素中4种苏丹红染料的定性定量分析。

关键词 辣椒红色素；高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）；苏丹红

中图分类号 TS207 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2024）17-0185-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.17.043

Determination of Sudan Red in Capsicum Pigment by HPLC-MS/MS

ZHANG Jin-lei， LU Li-liang， CHEN Yong-fa et al

（Analysis and Testing Center， Xinjiang Academy of Agriculture and Reclamation Science， Shihezi， Xinjiang 832000）

Abstract ［Objective］A high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS） method was developed for the simultaneous determination of four Sudan red dyes in capsicum red pigment.［Method］ The capsaicin pigment samples were extracted by n-hexane， purified by a special molecular imprinting column for Sudan red， separated by RP-HPLC on ZORABX SB-Aq C18 （3.0 mm×100 mm， 3.5 μm）， water gradient elution of acetonitrile -0.1% formic acid， ESI+ electrospray scanning. Sudan red in capsicum pigment was determined by multiple reaction monitoring （MRM） and quantified by external standard method. ［Result］The four Sudan red dyes showed a good linear relationship in the concentration range of 10.0-200 ng/mL， the detection limit was 5 μg/kg， and the quantification limit was 10 μg/kg. The average recovery was 71.0%-119.0% and the relative standard deviation was 1.53%-6.18% when the scalars were 10 μg/kg， 20 μg/kg and 50 μg/kg （n=6）. ［Conclusion］This method is suitable for the qualitative and quantitative analysis of four Sudan red dyes in chili red pigment.

Key words Capsicum pigment;HPLC-MS/MS;Sudan red

作者简介 张金磊（1991—），男，江苏南通人，助理实验师，从事食品质量安全检测研究。通信作者，高级实验师，硕士，从事食品质量安全检测研究。

收稿日期 2023-10-16

苏丹红属于偶氮类化工染色剂，主要用于溶剂、油、蜡和汽油的增色以及鞋、皮革等的增光。苏丹红有Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ号3种变体，它们均为I号的化学衍生物［1］。毒理学研究表明，苏丹红具有致突变性和致癌性，已被国际癌症研究机构列为三类致癌物之一，禁止作为色素添加剂在食品和饲料中使用［2-3］。

辣椒红色素是一类天然植物提取物着色剂，普遍存在于成熟的红辣椒的果皮中，属于类胡萝卜素，具有色泽鲜艳、着色力强、无毒、无害等优点，作为天然食品添加剂，被广泛用于食品、药品和化妆品等的着色。随着工业的快速发展，苏丹红会富集并存在于空气、土壤等环境中，在辣椒成长过程中会带入；另一方面，为了提高辣椒及制品的色泽，一些不法分子也会将苏丹红添加到辣椒中。辣椒中的苏丹红经食物链的传递，最终进入人体危害人们的健康，由苏丹红引起的食品安全问题也受到越来越多的关注［4-8］。辣椒红色素主要有辣椒红素、辣椒玉红素、R-胡萝卜素、黄体素及多种天然色素等脂溶性物质组成，基质较为复杂。苏丹红与辣椒红色素同为脂溶性物质，传统的液-液萃取及固相柱分离、净化效果难以满足辣椒红色素中苏丹红的检测要求，因此，样品的提取、净化成为辣椒红色素中苏丹红残留分析的关键。

目前对苏丹红的检测分析主要采用乙腈、丙酮、正己烷提取，固相萃取柱（氧化铝层析柱、MAX柱、分子印迹柱等）净化，高效液相色谱法［9-12］、高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）［13-15］、免疫法［16-17］、薄层色谱法［18-19］ 、电化学分析法［20-21］等检测。免疫法只能测单一组分，不满足多残留同时检测，并且容易出现假阳性。电化学分析法和薄层色谱法的选择性能力较弱，灵敏度较低，定性能力差。高效液相色谱法的灵敏度相对较低，并且抗干扰能力差。高效液相色谱-串联质谱法具有灵敏度高、抗干扰能力好、定性定量较为准确的优点。目前辣椒红色素中苏丹红的提取、净化和测定均存在一定的不足，发展一种准确度和灵敏度高的检测方法对辣椒红色素中苏丹红的监管具有重要意义，采用分子印迹柱净化结合高效液相色谱-串联质谱同时测定辣椒红色素中4种苏丹红鲜有报道。该研究在参考国内外测定方法的基础上，探讨了不同的试剂及固相小柱对苏丹红提取、净化效果的影响，获得了一种快速、高效、灵敏、准确的辣椒红色素中苏丹红的检测方法，为日常监管辣椒红色素的质量安全提供了技术支持。

1 材料与方法

1.1 试剂与试材

甲醇、乙腈、乙酸铵、甲酸，均为HPLC级，德国CNW公司；苏丹红Ⅰ～Ⅳ，纯度大于98.9%，德国Dr.Ehrenstorfer公司；超纯水；辣椒红色素，石河子红安公司，-20 ℃下冷冻保存备用。

1.2 仪器设备

液质联用仪（Agilent 1200-6460），美国Agilent公司；漩涡混合器（MS3 basic），德国IKA公司；高速冷冻离心机（Sigma 3-30k），德国Sigma公司；超声波清洗器（KQ-600DE型），昆山市超声仪器有限公司；超纯水仪（IQ7000），美国MilliQ公司。

1.3 HPLC-MS/MS检测条件

色谱柱为ZORABX SB-Aq C18（3.0 mm×100 mm，3.5 μm）；柱温30 ℃；流动相为0.1%甲酸水-乙腈；进样量5 μL；流速0.6 mL/min；梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1。

1.4 质谱条件

离子源为电喷雾离子源（ESI）；电离方式为ESI+；检测模式为MRM；喷嘴电压500 V；干燥器温度325 ℃；干燥器流速10 L/min；雾化器压力310.26 kPa；鞘气温度350 ℃；鞘气流速12 L/min。毛细管电压3 500 V。质谱采集参数见表2。

1.5 样品前处理

称取试样1.00 g（精确至0.01 g），置于50 mL离心管中，加入3 mL 正己烷，涡旋振荡2 min，超声提取10 min，以10 000 r/min离心5 min，取上清液于10 mL玻璃离心管中，残渣中分别再加入3 mL正己烷，重复提取2次，合并提取液，40 ℃水浴氮吹至5 mL左右，待净化。

将提取液全部通过活化好的MIP-SDH分子印迹柱（使用前依次用5 mL二氯甲烷和5 mL正己烷活化），5 mL正己烷淋洗，4 mL二氯甲烷洗脱并收集，40 ℃水浴氮吹至近干，1 mL乙腈溶解，超声20 s，过GHP滤膜，供高效液相色谱-串联质谱仪检测。

1.6 基质标准工作溶液配制

吸取一定体积的苏丹红Ⅰ～Ⅳ混合标准溶液，按“1.5”方法操作，氮吹至近干，1 mL乙腈溶解，超声20 s，过GHP滤膜，配制成基质标准工作溶液，供液相色谱-串联质谱仪检测。基质标准工作溶液应现用现配，4种苏丹红多反应监测（MRM）色谱图如图1所示。

2 结果与分析

2.1 质谱和色谱条件的优化

2.1.1 质谱条件的优化。

在电喷雾电离和多反应监测模式下，对200 ng/mL苏丹红Ⅰ～Ⅳ标准溶液流动注射泵连续进样，通过对洗脱溶剂温度、毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量等质谱参数进行优化。选择稳定性好、丰度高和干扰小的2个碎片离子作为苏丹红Ⅰ～Ⅳ定性离子和定量离子，并以丰度最强、响应值最高的离子对作为定量离子对。

2.1.2 色谱条件的优化。

比较水-乙腈、水-甲醇、0.1%甲酸水-乙腈、0.1%甲酸水溶液-甲醇和5 mmol/L乙酸铵溶液（含0.1%甲酸）-乙腈5种流动相体系对苏丹红响应值的影响，结果发现，当流动相为0.1%甲酸水-乙腈体系时，苏丹红Ⅰ～Ⅳ的响应值较高，因此该试验最终选择0.1%甲酸水-乙腈作为检测辣椒红色素中苏丹红Ⅰ～Ⅳ的流动相体系。

2.2 前处理条件的优化

2.2.1 提取溶剂的优化。

该试验研究了乙腈、丙酮、乙腈+丙酮（6+4）、正己烷+丙酮（1+1）和正己烷这5种溶剂对4种苏丹红的提取效果，结果如图2所示。以丙酮为提取溶剂时，苏丹红Ⅲ、Ⅳ的回收率均小于60%；而乙腈、乙腈+丙酮（6+4）和正己烷+丙酮（1+1）为提取溶剂时，苏丹红Ⅳ的回收率均为60%左右；而采用正己烷提取时，4种苏丹红的回收率均为90%左右，回收率最高，故该试验采用正己烷作为提取溶剂。

2.2.2 净化条件的优化。

该试验比较了不同固相萃取柱（EMR、MAX、Alumina-N、MIP-SDH）及QuEChERS净化方法对净化效果的影响，结果如图3所示。提取液经EMR、MAX和Alumina-N这3种固相萃取柱净化后，苏丹红Ⅰ～Ⅳ的回收率均小于70%；QuEChERS净化时，苏丹红Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的回收率为60%左右；而当采用MIP-SDH净化提取液时，4种苏丹红的回收率均大于90%。因此，该试验采用MIP-SDH固相萃取柱进行净化。

根据苏丹红和辣椒红色素的理化性质，该研究采用正己烷为淋洗溶剂，二氯甲烷为洗脱剂，进行洗脱条件优化，依次用5、6、7、8和9 mL正己烷淋洗小柱，5 mL二氯甲烷洗脱，试验结果见图4。当淋洗液体积为5 mL时，4种苏丹红均没有被洗脱下来，而当淋洗液体积为6 mL时，苏丹红Ⅰ、Ⅱ会有部分被洗脱下来；随着淋洗体积的增加，更多的苏丹红Ⅰ、Ⅱ会被洗脱下来。因此，该试验选择5 mL正己烷作为淋洗液。

在前处理过程不变的条件下，研究了二氯甲烷用量对洗脱效果的影响，结果如图5所示。当二氯甲烷用量为2 mL时，4种苏丹红的回收率均小于40%；当二氯甲烷用量增加至4 mL时，4种苏丹红的回收率均大于90%，继续增加二氯甲烷的用量，4种苏丹红的回收率增加不明显。因此，该试验选择4 mL二氯甲烷作为洗脱液。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系和检出限。

通过向辣椒红色素基质中添加苏丹红Ⅰ～Ⅳ标准品，按照“1.6”方法配制成基质标准工作溶液，在优化的前处理和仪器条件下，对4种苏丹红标准工作溶液进行了测定，以定量离子峰面积为纵坐标、浓度为横坐标进行回归分析。结果表明（表3），4种苏丹红在10～200 ng/mL呈现良好的线性关系（R2≥0.998 9）。在信噪比S/N为3时，4种苏丹红的检出限均为5 μg/kg；在信噪比S/N为10时，定量限均为10 μg/kg。这表明该方法线性关系良好、灵敏度高。

2.3.2 回收率和精密度。

任意选取一份辣椒红色素样品，按照该研究的方法进行3个浓度水平添加并测定回收率，每个水平重复测定6次，试验结果见表4，辣椒红色素中4种苏丹红的平均回收率为71.0%～119.0%，相对标准偏差（RSD）为1.53%～6.18%，说明该方法回收率和精密度良好。

2.3.3 实际样品测定。

利用该方法检测了新疆某公司不同生产批次的辣椒红色素样品，共计有50批次样品，其中有一批次样品检出苏丹红Ⅲ，检出量为25 μg/kg（图6），其余均未检出。

3 结论

采用SB-Aq色谱柱分离，优化了仪器和前处理条件，通过优化提取溶剂、提取溶剂体积和净化条件等因素，提高了辣椒红色素中4种苏丹红的提取效率。方法学验证和实际样品测定结果表明，该方法具有灵敏度高、准确性好、分析速度快的特点，适于辣椒红色素中4种苏丹红的定性定量检测。

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