不同澄清剂处理猕猴桃酒挥发性物质差异分析

摘要 ［目的］提升猕猴桃酒体稳定性，探究不同澄清剂对猕猴桃酒澄清度和感官品质的影响。［方法］以徐香猕猴桃为原料酿造猕猴桃酒，通过单因素试验结合响应面试验优化猕猴桃酒澄清工艺，采用HS-SPME-GC-MS（顶空固相微萃取及气相色谱-质谱联用技术）对猕猴桃酒中挥发性物质进行测定和分析。［结果］在PVP（聚乙烯吡咯烷酮）添加量1.2 g/L、明胶0.8 g/L、壳聚糖0.4 g/L的条件下猕猴桃酒的透光率达到95.7%。澄清后猕猴桃酒中共检测出30种香气成分，较澄清前（46种）减少，其中酯类物质减少16种，而烷烯烃类物质澄清后增加4种，表明澄清剂在改善猕猴桃酒澄清度的同时会造成其香气轮廓的改变，从而导致猕猴桃酒风味品质的降低。［结论］在有效解决猕猴桃酒沉淀的基础上，从挥发性小分子物质层面协同探究猕猴桃酒澄清效果，综合考虑了澄清处理对猕猴桃酒香气品质的影响，以期为猕猴桃酒澄清工艺提供新的优化思路。

关键词 猕猴桃酒；澄清剂；风味物质；工艺优化；气相色谱-质谱联用

中图分类号 TS262.7 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2024）17-0171-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.17.040

Analysis of Differences in Volatiles of Kiwifruit Wines Treated with Different Clarifiers

MA Feng-yan

（Xianyang Science and Technology Resource Coordination Center， Xianyang， Shaanxi 712000）

Abstract ［Objective］To enhance the stability of kiwifruit wine and explore the effects of different clarifying agents on the clarity and sensory quality of kiwifruit wine. ［Method］Using Xuxiang kiwifruit as raw material to brew kiwifruit wine， the clarification process of kiwifruit wine was optimized through single factor experiments combined with response surface experiments. HS-SPME-GC-MS was used to determine and analyze the volatile substances in kiwifruit wine. ［Result］The response surface experiment was used to optimize the best clarification process parameters： PVP （polyvinyl pyrrolidone） addition amount 1.2 g/L， gelatin 0.8 g/L， chitosan 0.4 g/L， under these conditions， the light transmittance of kiwi wine reached 95.7%;it was found that the types of volatile compounds （30） after clarification were significantly reduced compared with those before clarification （46）， including 16 esters and 4 alkenes，four kinds of alkenes were added after clarification.［Conclusion］Based on the analysis of kiwi wine precipitation， kiwi wine clarifiers were selected and the clarification process was optimized， the changes of volatile substances before and after clarification were analyzed sequentially， and the influence of clarification treatment on the aroma quality of kiwi wine was comprehensively considered， so as to provide a theoretical basis for the standardized evaluation of kiwi wine clarification process.

Key words Kiwi wine;Clarifier;Flavor substances;Process optimization;GC-MS

基金项目 陕西省哲学社会科学研究专项“推进咸阳市高新区高质量发展的路径与策略研究”（2022HZ1597）。

作者简介 马凤燕（1985—），女，回族，新疆沙湾人，工程师，硕士，从事科技创新研究。

收稿日期 2023-12-21；修回日期 2024-02-05

猕猴桃酒（kiwi wine）是一种以猕猴桃为原料发酵制备而成的低度果酒类产品，在保留猕猴桃营养成分与特征香气的基础上，适应消费者日益提高的口感和品味需求，同时旨在解决猕猴桃滞销与产品同质化问题，对完善猕猴桃产业链及提升附加值起到正向推动作用。然而，在储藏和销售过程中由于猕猴桃酒中的蛋白质和果胶物质与多酚类物质长时间共存，易出现沉淀或酒体浑浊等现象［1］，目前通过添加单一或联合澄清剂来提升酒体澄清度，是一种证实有效解决其沉淀问题的方法。因此，对澄清效果科学准确评价是标准化控制猕猴桃酒品质的关键因素之一，可为指导完善高品质猕猴桃酒加工工艺提供方法借鉴。

目前，在果酒生产过程中常采用的澄清剂有果胶酶、皂土、明胶、硅藻土、PVP、单宁溶液、壳聚糖等［2］，通过其物理和化学澄清原理使酒体达到不同的澄清效果。董瑞丽等［3］通过单因素和正交试验确定猕猴桃酒的最佳澄清工艺参数为壳聚糖添加量0.8 g/L、温度35 ℃、pH 5.0，经该澄清工艺处理后的猕猴桃酒透光率达到98.4%，这是由于带正电荷的壳聚糖会吸引带负电荷的果胶、纤维素等，结合形成絮凝物而沉淀，同时人工感官指标显示，猕猴桃酒均保留原有的口感与风味；徐洲等［4］通过研究4种常用澄清剂（明胶、酪蛋白、壳聚糖、钠基活性皂土）对猕猴桃干酒澄清度和稳定性的影响，结果发现，混合澄清剂的最佳配比为皂土0.45 g/L，明胶0.65 g/L，壳聚糖0.55 g/L，在该条件下澄清度可达95.42%，与壳聚糖澄清原理相似，皂土吸水膨胀后形成带负电荷的胶体细粒，可除去带正电荷的蛋白质等混浊物，从而使酒体得以澄清，同时酒精度、总糖、干浸出物、滴定酸、VC的含量均有所下降。目前针对猕猴桃酒澄清的研究多采用感官指标和理化参数评价澄清效果并进行工艺优化，同时猕猴桃酒中关于挥发性物质组成的研究也主要集中在不同酵母、不同猕猴桃品种和不同发酵工艺对比等方面［5］，关于澄清剂对澄清前后猕猴桃酒风味品质影响的研究鲜见报道。然而，猕猴桃酒的风味品质作为其整体品质评价重要指标之一，对澄清前后猕猴桃酒挥发性物质进行差异比较是深入解析其风味品质变化趋势的重要依据，因此基于猕猴桃酒现有传统评价体系进一步解析澄清前后挥发性物质差异比较，可更为全面地探究澄清剂对猕猴桃酒整体品质的影响规律并指导澄清工艺优化。顶空固相微萃取-气质联用（HS-SPME-GC-MS）技术是一种快速高效的挥发性物质萃取分析手段，可富集并萃取挥发性物质并准确定性与定量，具有前处理简单、分析时间短和重视性良好等特点［6］，目前在樱桃酒［7］、葡萄酒［8］、苹果酒［9］、黄酒［10］、蓝莓酒［5］、石榴酒［11］等果酒的挥发性成分研究中广泛应用［12］。

笔者选用明胶、PVP、壳聚糖、酪蛋白、皂土5种常见市售果酒澄清剂，探究不同澄清剂对猕猴桃酒澄清效果及风味物质变化的影响，采用响应面法确定最佳澄清剂的配比，顺次采用HS-SPME-GC-MS对猕猴桃酒中挥发性物质进行定量分析，对比澄清前后挥发性物质差异，进一步解析澄清剂对猕猴桃酒挥发性物质组成影响规律，以期为猕猴桃酒的澄清技术改良与创制提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原料：徐香猕猴桃，购于陕西省周至县猕猴桃种植园。

试剂：果胶酶（3万U/mL），河南万邦实业有限公司；果酒酵母，安琪酵母股份有限公司；白砂糖，购于超市；PVP（聚乙烯吡咯烷酮，98%），上海蓝季科技发展有限公司；明胶（食品级），河南博洋生物科技有限公司；壳聚糖（食品级），青岛弘海生物技术有限公司；皂土，天津科密欧有限公司；酪蛋白（食品级，94%），甘肃华羚乳品股份有限公司；正构烷烃（C7～C40，色谱级）、1，2-二氯苯（色谱级），均购于美国Sigma-Aldrich 公司。

1.2 仪器与设备

YP30002电子天平，上海佑科仪器仪表有限公司；752型紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；800电动离心机，上海梅香仪器有限公司；HH-4A数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；手动SPME进样器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头、7890B-5977B气相色谱-质谱联用仪，美国Supelco公司；DB-WAX毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm，Agilent 122-7032），美国安捷伦公司。

1.3 试验方法

1.3.1 猕猴桃酒酿造工艺。

挑选无病虫害、成熟度集中的新鲜猕猴桃，用流水清洗干净后手工剥皮捣碎［13］，准确称取700 g猕猴桃果浆汁置于发酵瓶中，将其放入恒温水浴锅加热至45 ℃后，加入0.35 g果胶酶处理1 h，取出后置于100 ℃灭酶5～6 min，放凉备用。然后称取2 g果酒酵母加入35 g糖水中，在38 ℃条件下活化30 min，冷却至室温后加入猕猴桃果浆汁中，混合均匀，在18～26 ℃下发酵15 d，第3天分离酒脚，主发酵结束进入后发酵，期间倒罐3次，经过滤处理得到猕猴桃酒。

1.3.2 澄清剂单因素试验及响应面优化。

（1）澄清剂的配制。

皂土溶液：称取1.0 g皂土置于烧杯中，加入20 mL热水（ 50 ℃左右）充分浸泡膨胀24 h，使之形成胶体悬浮液，加水定容至100 mL，备用。壳聚糖溶液：称取1.0 g壳聚糖，加入80 mL 2%柠檬酸水溶液，充分溶解后加水定容到100 mL，振荡混匀后备用［14］。酪蛋白溶液：称取1.0 g酪蛋白置于烧杯中，加入少量水使其湿润后，加入4 mL 0.2 mol/L NaOH溶液，摇匀，80 ℃水浴15 min，充分溶解后冷却至室温，加水定容至100 mL，保存于冰箱内［15］。PVP溶液：称取1.0 g PVP，加入少量水使其充分溶解，后加水定容至100 mL。明胶溶液（现用现配）：称取1.0 g明胶置于烧杯中，加入10～15 mL水，用保鲜膜将其封口使其充分膨胀，10 min后再加入15～20 mL水，于55 ℃水浴加热使其充分溶解，待冷却至室温后加水定容至100 mL。

（2）透光率最佳波长的确定。

取猕猴桃酒样上清液置于石英比色皿中，以蒸馏水为空白对照，用紫外可见分光光度计在380～820 nm，每隔20 nm测定澄清酒样透光率，以确定猕猴桃酒澄清度的最佳波长。

（3）不同澄清剂的单因素试验。

将5种澄清剂皂土、壳聚糖、明胶、PVP、酪蛋白均配制为1%的溶液，备用。将300 mL猕猴桃酒样分别置于30个50 mL锥形瓶中，依次添加0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g/L浓度的5种澄清剂，静置5 d后，采用3 000 r/min转速离心处理60 s，取上清液用石英比色皿在最佳波长处测定透光率（%），与未添加澄清剂的原酒样作为对照，比较不同添加量澄清剂对猕猴桃酒的澄清效果［4］，试验均重复3次平行。

（4）筛选极端添加量下不同澄清剂对猕猴桃酒的澄清效果。

为精确细分不同澄清剂的最优澄清效果，设置极端添加量试验。取猕猴桃酒样各10 mL，分别添加2.0 g/L浓度的5种澄清剂，设置空白对照，平行3组。静置5 d后，采用3 000 r/min转速离心处理60 s，取上清液后分别测定透光率。①在最佳波长下测定；②在水浴加热（60 ℃，20 min）待其冷却至室温后测定。

（5）响应面优化复合澄清剂试验设计。

在上述试验的基础上，为深入明晰优化复合澄清剂参数，以明胶添加量（A）、PVP添加量（B）、壳聚糖添加量（C）为因素，透光率（Y）为响应值，采用Design-Expert 10.0.4软件进行 Box-Behnken 响应面试验设计。试验因素与水平见表1。

1.3.3 风味物质的定性与定量。

（1）HS-SPME提取。将澄清前、PVP、明胶、壳聚糖及优化处理后的5种酒样各取5 mL置于20 mL顶空瓶中，同时加入1 μL内标物1，2-二氯苯（溶于甲醇，质量浓度为1.306 μg/μL），随即用聚四氟乙烯-硅橡胶隔垫密封，50 ℃下平衡7 min，然后将老化好的萃取头插入顶空瓶，顶空萃取吸附20 min，萃取结束后立即置于GC进样口热解析（250 ℃，7 min）。以上试验重复3次。

（2）GC条件。采用DB-WAX色谱柱（30 mm×0.250 mm×0.25 μm）对猕猴桃酒进行分析；不分流进样；载气为纯度>99.999%的氦气，流速为3 mL/min；程序升温：初始温度为50 ℃，保持时间3 min，以5 ℃/min速率升至180 ℃保持3 min，再以8 ℃/min速率升至230 ℃保持3 min。

（3）MS条件。质量扫描范围35～400 m/z ；EI电离模式；电离电压70 eV；离子源温度230 ℃。

（4）定性方式。将未知化合物的质谱与NIST质谱数据库匹配进行对比，并结合相关文献进行对照。

（5）定量方式。选用1，2-二氯苯为内标物质，采用内标法进行定量，计算公式如下［16］：

待测组分含量（μg/L）=（待测组分的峰面积×内标物浓度）/内标物的峰面积

1.3.4 数据处理。

采用Design-Expert 10.0.4软件分析试验数据，采用 Origin 2015软件制图。

2 结果与分析

2.1 猕猴桃酒透光率最佳波长的确定

将猕猴桃酒在380～820 nm波长区间每隔20 nm测定透光率，所得结果如图1所示。从图1可以看出，随着波长的增大，透光率呈先急后缓的上升趋势，在380～620 nm波长区间透光率显著增加，在680 nm下透光率达到最大值81.6%，超过680 nm透光率变化幅度较小，趋于平缓。因此，选定680 nm为测定猕猴桃酒澄清度的最佳波长。

2.2 不同澄清剂对猕猴桃酒澄清度的影响

在680 nm波长条件下，测定猕猴桃酒在不同澄清剂和不同添加量下的透光率，测定结果见图2。从图2可知，随着添加量的改变，不同澄清剂测定的透光率发生显著变化。随着皂土添加量的增加，透光率整体呈缓慢减少的趋势，在0.2 g/L处透光率达到最大值95.3%，当其添加量超过1.0 g/L时，透光率显著下降，这是由于皂土过量导致酒体浑浊。壳聚糖添加量在0.2～0.8 g/L时，随着添加量的增加，透光率显著升高，当添加量为0.8 g/L时，透光率达到最大值98.2%，超过0.8 g/L时透光率显著下降，这可能由于壳聚糖在果汁中为悬浮状，给酒体带来浑浊观感，从而使澄清度降低［17］。随着酪蛋白添加量的增加，透光率整体呈先减后增的趋势，这与罗安伟等［1］研究的酪蛋白对猕猴桃酒澄清度和色度的结果一致。与酪蛋白和壳聚糖相反，PVP随着添加量的增加，透光率呈整体增加的趋势，这是由于其吸附除去多酚类、羧酸和小分子物质等，从而达到澄清原酒的目的，当添加量为1.2 g/L时透光率达到最大值96.2%。然而，随着明胶添加量的增加，透光率整体呈下降趋势，在0.2 g/L处透光率达到最大值91.2%，这可能由于明胶过量而猕猴桃酒中单宁量不足造成酒体更加浑浊，澄清效果为5种澄清剂中最差。

2.3 筛选不同澄清剂在极端添加量下猕猴桃酒的最佳澄清度

由表2可知，除酪蛋白外，加入澄清剂后的上清液、加热处理酒样的透光率与空白对照相比有明显提高。比较加热处理酒样的透光率可知，PVP、壳聚糖澄清效果明显，明胶虽低于皂土，但仅差0.14百分点和0.18百分点，综合考虑试验中存在的系统误差及企业在实际生产中的操作、成本因素，确定选择明胶。又因壳聚糖是一种无毒，可生物降解，具有多阳离子性质的高效混凝剂，可有效分离饮料中的悬浮颗粒，对酒的口感、色度与成分影响不大［3］，且其优良的絮凝性能，已被众多报道证实是一种高性价比的新型澄清剂［18］。因此，选择明胶、PVP、壳聚糖3种澄清剂用于工艺优化试验。

2.4 响应面优化复合澄清剂试验分析

2.4.1 响应面因素设计。

以单一澄清剂试验结果为考量，为进一步优化复合澄清剂工艺，以明胶添加量（A）、PVP添加量（B）、壳聚糖添加量（C）为因素，透光率（Y）为响应值进行响应面优化试验，试验结果见表3。

采用Design-Expert 10.0.4软件对试验结果进行多元回归拟合，获得透光率的二次多项回归方程如下：Y=90.800 00+8.068 75A+10.318 75B－9.587 50C+1.734 72E-16.000 00AB+4.218 75AC+8.281 25BC－6.468 75A2－8.031 25B2－1.312 50C2。

由表4响应面方差分析结果可知，上述所建立的回归模型显著（P<0.05），失拟项不显著（P>0.05），表明模型在线性范围

内拟合效果较好，试验误差较小，可以预测复合澄清剂对猕猴桃酒的澄清效果，变异系数低（CV=1.16%），CV值越小，表明该模型具有良好的精度和可靠性［19］。根据F值的大小判断出各因素对猕猴桃酒透光率的影响表现为PVP添加量（B）>壳聚糖添加量（C）>明胶添加量（A），其中一次项B、交互项BC、二次项B2达到显著水平（P<0.05）。综合上述试验结果可知，该模型能良好地反映出猕猴桃酒透光率与各因素之间的关系。

2.4.2 响应面分析及条件优化。

为进一步探究各变量之间的交互作用及确定复合澄清剂的最优条件，绘制响应面3D图和等高线图［20］。图3a、图3b、图3c依次为AB、AC、BC 3组交互作用与猕猴桃酒透光率构成的响应面3D图［21］，图3d、图3e、图3f分别为AB、AC、BC 3组交互作用与猕猴桃酒透光率构成的等高线图，可直观地反映2变量交互作用的显著程度，响应面形状陡峭，等高线密集，说明两者交互作用显著［22］。从图3a、图3b可以看出，等高线图呈圆形，形成的曲线坡度较小，表明AB交互作用对猕猴桃酒透光率影响不显著；从图3c、图3d可以看出，等高线稀疏，响应面形状较平缓，表明AC交互作用对猕猴桃酒透光率影响不显著；从图3e、图3f可以看出，等高线密集，响应面形状陡峭，随着各因素的增加呈现显著的增减趋势，表明BC交互作用对猕猴桃酒透光率影响显著，这与方差分析结果一致。综合图3和表4分析得出猕猴桃酒复合澄清剂的最优条件为明胶添加量为0.8 g/L，PVP添加量为1.2 g/L，壳聚糖添加量为0.4 g/L，该条件下猕猴桃酒的透光率为95.70%，与预测值95.21%接近，表明该模型能较好地预测猕猴桃酒的澄清度。

2.5 澄清处理前后猕猴桃酒中风味物质变化

采用HS-SPME-GC-MS技术对猕猴桃酒中的风味物质进行富集和筛选，经计算机谱库检索和NIST数据库识别、匹配，并结合相关文献进行比对，综合筛选确定出5种猕猴桃酒样品中的挥发性物质，最后，采用内标法进行定量，每个试验重复3次，得到数据见表5［23］。

由表5可知，从5种不同处理的猕猴桃酒样中共鉴定出64种香气物质，包括醇类物质18种，酯类物质26种，酸类物质6种，醛酮类物质7种，烷烯烃类物质7种。其中，酯类物质占有绝对优势，以乙酸异戊酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯等为主，由醇和酸通过酯化反应生成特有的类似水果香味，是能够赋予果酒愉悦味道的香气物质［24］，因此该类物质在猕猴桃酒香气成分中占重要位置，如乙酸异戊酯可以赋予酒类新鲜果香和苹果的香气，澄清后猕猴桃酒中乙酸异戊酯的含量增加了42.76%，辛酸乙酯具有令人愉快的花果香气、杏子香气，癸酸乙酯具有葡萄的水果香气［25-26］，澄清后猕猴桃酒中辛酸乙酯和癸酸乙酯的物质含量有所减少。苯乙醇、异戊醇等醇类物质含量较高，其中异戊醇含量最高，为猕猴桃酒中的主要醇类，它们主要由缬氨酸代谢产生并且都具有特殊的果香和酒香［27］，但其过量也会使酒产生异味，会严重影响酒的质量与风味，使酒具有不愉快的苦味［28］，澄清后猕猴桃酒中异戊醇的含量有所降低，可能会对猕猴桃酒的口感产生影响；苯乙醇具有玫瑰香、紫罗兰香、茉莉花香等多种风味，也是构成猕猴桃酒香气的主要成分之一［25］。酸类物质的含量仅次于酯类、醇类物质，以辛酸、乙酸等为主，由于闻香阈值很高，因此对猕猴桃酒的香气贡献并不大［29］。以上研究表明，对猕猴桃酒进行澄清处理会使酒中的挥发性物质有所损失，其中风味物质数量和种类较澄清前原酒有所减少，但与猕猴桃果酒呈香相关的关键酯类和醇类物质基本被保留。

澄清前后猕猴桃酒中风味物质的数量对比如图4所示，在原酒、PVP、明胶、壳聚糖、优化处理后的猕猴桃酒中分别鉴定出46、34、33、26、30种挥发性物质，经不同澄清剂处理的猕猴桃酒风味物质组成发生显著变化，其中原酒中检测出醇类物质13种，酯类物质22种，酸类物质6种，醛酮类物质4种，烷烯烃类物质1种，经复合澄清剂优化处理后的猕猴桃酒中酯类物质减少了16种，醇类和酸类物质均有所减少，烷烃类等对风味无明显贡献的挥发性物质增加，其中新生成的3，7，7-三甲基-1，3，5-环庚三烯、二十六烷、二十七烷、二十八烷、四十四烷等，可能是由于澄清剂的作用释放了猕猴桃酒中部分结合态挥发性物质。

3 结论

该研究基于不同澄清剂的单因素试验和Box-Behnken设计试验，采用响应面分析方法优化澄清剂参数，得到最佳澄清工艺参数：PVP添加量1.2 g/L、明胶0.8 g/L、壳聚糖0.4 g/L，该条件下猕猴桃酒的透光率为95.7%。采用HS-SPME-GC-MS对澄清前后的猕猴桃酒中的挥发性物质进行对比分析，澄清前后猕猴桃酒中分别检测出46和30种挥发性物质，澄清后的猕猴桃酒中酯类物质显著减少，如具有花香气味的辛酸乙酯和具有果香气味的癸酸乙酯，而烷烯烃类物质显著增加，如二十七烷、二十八烷、四十四烷等。结果表明，不同的澄清剂处理会造成猕猴桃酒的挥发性物质组成发生差异性改变，即使猕猴桃酒的澄清度指标最佳，但澄清剂会造成猕猴桃酒挥发性轮廓改变，从而导致猕猴桃酒风味品质降低，因此基于澄清度等理化指标优化复合澄清剂工艺，结合风味品质作为关键指标进行优化，可为实现生产高澄清度与优良风味品质双导向的猕猴桃酒奠定了理论基础。

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